片葉苔素D及其衍生物抗腫瘤機制的研究和鼠李糖受體的發(fā)現(xiàn).pdf

1、植物藥一直是天然藥物的重要組成部分，也是人類防病治病的主要來源。惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并且臨床上腫瘤耐藥時有發(fā)生，促使人們將希望寄托于尋找新型的天然抗腫瘤藥物，以期發(fā)現(xiàn)療效更好或具有新靶點的化合物。目前為止，世界上許多國家對抗腫瘤新藥的研究投入大量的人力和財力，自然界數(shù)以百萬計的植物、動物、微生物、海洋生物是新藥研發(fā)的重要源泉。
　　 苔蘚植物屬于高等植物中較低的類別，多數(shù)生長在陰暗潮濕的環(huán)境中。在植物界的演化進程中，

2、苔蘚植物代表著從水生逐漸過渡到陸生的類型，依據(jù)形態(tài)可分為苔綱(Liverworts)、蘚綱(Mosses)和角苔綱(Hornworts)3類。苔蘚植物含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，以萜類和酚類化合物為主，具有廣泛的生物學活性。雙聯(lián)芐類化合物是苔蘚植物中的一類特征性的組分，近年來的研究表明，雙聯(lián)芐類化合物具有多種生物學活性，包括抗腫瘤、抗細菌、抗真菌等。RiccardinD(RD)是一種雙聯(lián)芐類化合物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細胞中誘導細胞凋亡

3、，然而具體機制還有待進一步研究。另外，RD除了引起細胞凋亡，是否誘導其他類型的細胞死亡如自噬性死亡還沒有被證實。在本論文中，我們研究了RD在人類成骨肉瘤U2OS(p53野生)和Saos-2(p53缺失)細胞中誘導細胞死亡的方式和機制。MTT方法揭示RD引起成骨肉瘤細胞U2OS和Saos-2濃度和時間依賴性的死亡，而對人類正常成骨細胞則毒性很小。用PI染色流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，RD導致U2OS和Saos-2細胞阻滯在G0/G1期;Weste

4、rnblot方法檢測RD對細胞周期蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)RD在兩種細胞中都能引起cyclinD和cyclinE這兩種G1期蛋白表達水平的下調和細胞周期蛋白抑制劑p21WAF1的上調，同時在U2OS細胞中誘導p53表達水平的增加。在p53抑制劑存在的情況下，RD仍然導致U2OS細胞G0/G1期阻滯。細胞周期阻滯往往伴隨著細胞凋亡，DAPI染色顯示RD誘導成骨肉瘤細胞核固縮，斷裂;AnnexinV/PI雙染并用流式細胞儀測定了細胞的凋亡率;Wes

5、ternblot顯示RD能夠引發(fā)caspase依賴的凋亡，同時伴有Bax的降低和Bcl-2的增加。進一步的研究表明，p53抑制劑不影響RD促進凋亡的作用，而caspase抑制劑能夠部分逆轉RD誘導的凋亡，這表明RD在成骨肉瘤細胞中介導p53非依賴而caspase部分依賴的凋亡。除了細胞凋亡，RD在成骨肉瘤細胞中引起自噬，表現(xiàn)為LC3B-Ⅱ的積累，AVOs的形成，LC3B-Ⅱ焦點和自噬流的增加。自噬阻斷劑3MA和E64d能夠抑制自噬的過程

6、，明顯減弱RD介導的細胞死亡，敲除自噬形成時的一個重要蛋白ATG5的內源性表達也能夠抑制自噬流的形成。此外，自噬和caspase的抑制劑聯(lián)合用藥能夠明顯減少細胞的死亡率。綜上所述，RD在成骨肉瘤細胞中同時誘導細胞凋亡和自噬。
　　 對于RD抗腫瘤活性的研究取得了初步的進展，然而RD活性中等，這促使我們對其進行修飾合成一系列衍生物以提高生物學活性，并發(fā)現(xiàn)更有效的抗癌藥物。在各種衍生物中，氨甲基化的產(chǎn)物riccardinD-N(RD

7、-N)活性較好可以作為一種潛在的候選抗癌藥。為了探討RD-N作用的藥理學和分子生物學機制，首先用MTT法對其細胞毒活性進行了檢測，RD-N對多種腫瘤細胞都具有抑制活性，其中對前列腺癌PC3的作用比較顯著，而對正常細胞則毒性較小，說明RD-N對細胞作用具有選擇性。因此，對RD-N機制的研究我們選擇前列腺癌PC3、DU145和LNCaP細胞。AnnexinV/PI雙染并用流式細胞儀測定RD-N對PC3、DU145和LNCaP細胞的凋亡率，w

8、esternblot檢測凋亡的標志蛋白PARP的剪切，這兩個實驗說明了RD-N能夠誘導前列腺癌細胞凋亡。對于RD-N能否破壞細胞膜，我們采用LDH酶活的測定和PI熒光染色法來評價，實驗結果表明RD-N對PC3細胞膜能誘導通透性增加的作用。細胞內ATP的水平隨著加藥濃度的升高而降低，而ATP的耗竭是細胞凋亡轉變?yōu)閴乃罆r的一個標志，以上結果說明RD-N同時能夠誘導前列腺癌細胞發(fā)生壞死。此外對RD-N的亞細胞分布進行了研究，采用蔗糖密度梯度超

9、速離心分離溶酶體和線粒體并且利用HPLC測定化合物在細胞器中的累積，發(fā)現(xiàn)在PC3細胞中，RD-N能優(yōu)先累積于溶酶體內。RD-N累積于溶酶體后，促使溶酶體體積增大，容易發(fā)生溶酶體透化作用(LMP)。為了檢測RD-N是否引起LMP，我們采用溶酶體的兩個特異性探針LysotrackerRed和AO，通過流式細胞儀測定熒光強度，發(fā)現(xiàn)RD-N在3種前列腺癌細胞中均產(chǎn)生LMP作用。溶酶體發(fā)生LMP后釋放組織蛋白酶(cathepsin)入細胞質，ea

10、thepsinB的抑制劑而不是cathepsinD和L的抑制劑能夠明顯逆轉RD-N誘導的細胞死亡。另外，RD-N能夠通過降低tubulin和actin的表達而影響細胞骨架系統(tǒng)，使細胞周期阻滯在G2/M期。體內實驗表明，RD-N對裸小鼠前列腺癌移植瘤模型有明顯的抑瘤作用，H&E和TUNEL染色顯示RD-N是通過引起細胞凋亡的作用機制抑瘤。因此，RD-N體外通過溶酶體損傷誘導細胞死亡，體內能夠抑制腫瘤生長。
　　 RD-N引起溶酶體

11、膜透化作用釋放cathepsinB促使腫瘤細胞死亡，然而cathepsinB具體的作用機制尚未闡明，需要進一步的研究。通過PI或TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，用小干擾RNA(siRNA)干擾內源性cathepsinB的表達能夠明顯減少RD-N引起的細胞死亡和染色質溶解，而轉染cathepsinB的表達質粒使其過表達則能夠促進RD-N引起的細胞死亡和染色質溶解。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，PC3細胞經(jīng)過RD-N處理后cathepsinB首先從溶酶體中釋放出來

12、然后進入細胞核，整個過程中蛋白表達增加，酶活性增高。RD-N誘導細胞死亡的過程中，同時有DNA損傷的發(fā)生，表現(xiàn)為ATM/ATR通路的激活，下游chk2和chk1分別磷酸化，損傷蛋白H2AX和修復蛋白BRCA1的磷酸化。為了尋找cathepsinB引起細胞死亡的下游作用靶點，我們應用激光共聚焦共定位、蛋白-蛋白對接、免疫共沉淀和小干擾RNA等方法，發(fā)現(xiàn)cathepsinB進入細胞核以后和BRCA1相互作用并降解BRCA1蛋白，干擾DNA修

13、復的過程，促進RD-N引起的DNA損傷。
　　 對于從中藥茄屬類植物龍葵中分離得到的甾體生物堿類化合物solamargine，solasonine，solasodine和合成的solasodine的兩個衍生物抗腫瘤活性的研究，我們發(fā)現(xiàn)鼠李糖部分在誘導細胞死亡中起著至關重要的作用，而包含兩個鼠李糖基的化合物solamargine表現(xiàn)出最強的抗腫瘤活性。進一步的實驗顯示，solamargine對不同腫瘤細胞株也表現(xiàn)出不同的細胞毒作用

14、，PC3和KB細胞比HT-29和MCF-7對solamargine更敏感。為了確定皂苷中的糖基如何發(fā)揮作用，我們設計合成了生物素化的馬鈴薯三糖，鼠李糖和葡萄糖與鏈霉親和素鍵合的量子點結合，與腫瘤細胞共同孵育，發(fā)現(xiàn)鼠李糖探針和三糖探針的在細胞膜上的紅色熒光比葡萄糖探針的熒光強。我們已經(jīng)知道，鼠李糖對鼠李糖結合受體有高度的親和性，因此，我們證明了腫瘤細胞膜表面的RBL受體在介導皂苷的抗腫瘤活性方面發(fā)揮著重要的作用。通過生物素化的糖和鏈霉親和

15、素鍵合的量子點結合，我們建立了一種原位觀察腫瘤細胞膜表面鼠李糖結合凝集素的方法，并且第一次用這種方法觀察到了RBL受體。根據(jù)該方法，我們檢測了不同腫瘤細胞膜表面RBL受體的表達，發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤細胞或組織有不同的RBL受體的表達，RBL受體高表達的腫瘤細胞對皂苷更為敏感。不同腫瘤細胞表面不同RBL受體表達水平的研究為腫瘤的診斷和藥物敏感性研究提供了基礎。此外，鑒于鼠李糖在藥物吸收中的重要作用，許多化療藥物可以結合鼠李糖，以增加藥物的攝取和

16、定位。
　　 本論文首次報道了RD除了引起細胞凋亡還能誘導自噬性死亡。為了提高RD的作用效果，合成了新的衍生物RD-N，并證明RD-N是一種靶向溶酶體的藥物，通過溶酶體透化作用誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡和壞死;溶酶體通透性增加后釋放cathepsinB進入細胞核，降解BRCA1同時促進DNA損傷，這是本文發(fā)現(xiàn)的cathepsinB的一個新功能。論文還對腫瘤細胞表面的RBL受體進行了研究，發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤細胞存在不同的RBL受體的表達，R