有髓鞘神經(jīng)纖維在激痛點所致肌筋膜疼痛綜合征中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分大鼠股二頭肌激痛點定位方法及神經(jīng)纖維分布的相關(guān)研究
　　研究背景：
　　肌筋膜疼痛綜合征(Myofascial pain syndrome，MPS)是一類常見的疼痛綜合征，以激痛點(myofascial trigger points，MTrPs)的出現(xiàn)為特征。激痛點是肌緊張帶中的痛性易激惹小點，直徑約為1～2毫米，受到按壓、針刺等刺激時產(chǎn)生局部抽搐反應(yīng)、牽涉痛、自發(fā)性電活動等。激痛點會造成受累肌肉肌束縮短、肌力減弱，

2、從而導致關(guān)節(jié)活動度受限等運動功能異常。
　　幾乎每人都有激痛點，可出現(xiàn)于全身任意肌肉組織中，但現(xiàn)在對于激痛點的成因仍然存在許多爭議。學者們提出幾種理論，其中比較著名的是能源危機理論（整合理論）及對其做出進一步補充的Cinderella假說，認為肌肉勞損導致局部能量危機、神經(jīng)活性物質(zhì)釋放增多并最終使外周傷害性感受器敏化，造成痛覺過敏。另一種理論——神經(jīng)肌肉接頭功能障礙理論認為激痛點由許多運動或感覺相關(guān)小區(qū)域組成，這些小區(qū)域各自對激痛

3、點的運動或感覺特征負責。
　　現(xiàn)有關(guān)于激痛點的研究多為人體實驗，鑒于有些實驗項目，特別是有創(chuàng)性操作，很難在人體實驗開展，所以動物實驗是十分必要的。既往動物實驗多通過同一部位反復擊打、離心運動等來誘發(fā)激痛點。考慮到這些措施多為傷害性操作，可能會對后續(xù)實驗結(jié)果造成干擾（如反復多次擊打等操作本身即可誘發(fā)相應(yīng)脊髓層面的中樞敏化，而且會造成局部肌纖維損傷）。另外有學者使用局部注射藥物的方式來誘發(fā)激痛點，但注射操作及藥物可能對局部微環(huán)境造成改

4、變。因此，需要一種更加準確的激痛點動物模型來更好的模擬人體激痛點。此外，在人體實驗中，可以通過詢問受試者有無局部疼痛（特別是可辨認的與既往疼痛相似者）的主觀體驗來協(xié)助確定激痛點。然而，在動物實驗中，很難通過實驗動物的主觀體驗來定位，僅能通過其疼痛避縮反應(yīng)來衡量疼痛，卻無法判斷疼痛是否之前即存在，而且無法判斷是否有牽涉痛的存在。因此，在動物實驗中，需要有更加可靠的激痛點定位方法。
　　既往研究顯示激痛點處有痛覺過敏、痛覺超敏現(xiàn)象。同

5、時有學者使用鐵沉積法發(fā)現(xiàn)激痛點處有更多的神經(jīng)纖維末梢存在。有臨床報道指出有髓鞘神經(jīng)纖維參與某些疼痛的傳導，缺血壓迫阻滯有髓鞘纖維可以緩解人體激痛點的疼痛和牽涉痛。由此我們推測，有髓鞘神經(jīng)纖維可能與激痛點存在聯(lián)系。
　　本實驗中，我們采用大鼠股二頭肌內(nèi)自然形成的激痛點作為研究對象，以更好的模擬人體激痛點。通過觸診結(jié)合肌電圖定位的方式來定位:即在肌肉觸診初步定位激痛點后，使用針刺肌電圖進一步確定此處是否存在激痛點特異性的自發(fā)性電活動，

6、以此增加定位的準確性。同時，我們對此種方法取得的激痛點做了活檢，并與正常肌肉組織做了對比。為進一步研究激痛點的神經(jīng)支配，特別是有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點的聯(lián)系，我們采用了改良的Cajal吡啶銀染色對激痛點處的神經(jīng)纖維末梢進行了研究，而且通過有髓鞘神經(jīng)纖維特異性抗體(NF200)的免疫組織化學實驗，對激痛點的有髓鞘神經(jīng)纖維分布做出進一步分析。
　　目的：
　　1.尋找定位大鼠股二頭肌中自然形成的激痛點，作為臨床激痛點的動物模型。<

7、br>　　2.研究大鼠激痛點相應(yīng)形態(tài)學改變，并與正常肌肉組織進行對比。
　　3.明確大鼠激痛點的神經(jīng)纖維、有髓鞘神經(jīng)纖維支配情況。
　　研究方法：
　　1.大鼠股二頭肌內(nèi)自然形成的激痛點/非激痛點的定位
　　取260～270g重的清潔級Wistar大鼠，淺麻醉后俯臥位固定，清除股后部毛發(fā)。首先以觸診方式確定大鼠股二頭肌內(nèi)較為堅硬的肌緊張帶，沿該肌緊張帶擠壓，當該側(cè)下肢出現(xiàn)局部緊張反應(yīng)時，可初步認定此處為激痛點。繼

8、而以肌電圖測定，當刺入初步確定的激痛點處的刺激電極記錄到自發(fā)性電活動，而刺入臨近肌肉中的對照電極無自發(fā)性電活動時，可進一步確認激痛點。非激痛點處無自發(fā)性電活動且無局部緊張反應(yīng)。
　　2.大鼠股二頭肌激痛點及非激痛點的取材
　　確定激痛點/非激痛點后，保持刺激電極不動，逐層切開皮膚及皮下組織，暴露股二頭肌。取下刺激電極針頭附近直徑3mm的肌肉。
　　3.大鼠股二頭肌激痛點/非激痛點肌肉組織的活檢
　　所取激痛點/非

9、激痛點組織塊經(jīng)4％多聚甲醛固定過夜、組織脫水、石蠟包埋、組織切片，制成4μ m厚的切片。光鏡下觀察肌纖維分布及走行等形態(tài)學改變。
　　4.改良的Cajal吡啶銀染色示激痛點/非激痛點處神經(jīng)纖維
　　按照改良的Cajal法，對取材的激痛點/非激痛點組織塊依次進行:固定、硝酸銀著色、焦性沒食子酸還原等操作后，經(jīng)過組織脫水、石蠟包埋，4μ m縱/橫切片、脫蠟水化、脫水透明、封片，進行光鏡下觀察，計數(shù)被銀染為棕黑色的神經(jīng)末梢數(shù)目。<

10、br>　　5.NF200免疫組化檢測激痛點/非激痛點有髓鞘神經(jīng)纖維
　　取激痛點/非激痛點組織塊，經(jīng)4％多聚甲醛固定過夜、組織脫水、石蠟包埋，制成4μ m縱/橫切面切片。進行NF200免疫組織化學方法檢測激痛點/非激痛點組織中有髓神經(jīng)纖維末梢，光鏡下計數(shù)棕黃色的陽性神經(jīng)末梢數(shù)量。
　　6.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計
　　銀染/NF200陽性神經(jīng)纖維數(shù)目均采用平均值±標準差的方式記錄，對其差異分別進行t檢驗。若P＜0.05，認為差異

11、有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.使用觸診結(jié)合肌電圖檢測自發(fā)性電活動的方法可以成功定位大鼠股二頭肌內(nèi)自然形成的激痛點。
　　2.激痛點/非激痛點活檢:激痛點處肌纖維排列錯亂、增粗腫脹，其中可見收縮帶及較多炎性細胞浸潤，非激痛點處肌纖維排列整齊，無明顯炎性浸潤。
　　3.改良Cajal吡啶銀染色:肌肉縱切面:在激痛點和非激痛點的肌纖維間隙可見被銀染為棕黑色的神經(jīng)纖維沿肌纖維走向分布。肌肉橫切面:激痛點處銀染的神經(jīng)

12、纖維數(shù)量較多(15.97±1.67)，非激痛點處銀染纖維數(shù)量少(11.06±1.54)，二者差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　4.NF200染色顯示:肌肉縱切面:激痛點和非激痛點的肌纖維間隙均可見NF200陽性的棕黃色的神經(jīng)纖維。肌肉橫切面:激痛點處NF200陽性神經(jīng)纖維數(shù)量較多(5.720±1.31)，非激痛點處NF200陽性纖維數(shù)量較少(2.930±1.09)，二者差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　結(jié)論：

13、　　1.肌肉觸診結(jié)合肌電圖定位的方式可以確定大鼠股二頭肌中自然形成的激痛點，作為人體激痛點的動物模型。
　　2.激痛點中肌纖維排列錯亂、略有腫脹，可見有緊張帶形成及較多炎性細胞浸潤。
　　3.激痛點有更多的神經(jīng)纖維末梢存在，特別是有髓鞘神經(jīng)纖維末梢。
　　4.結(jié)合既往臨床試驗結(jié)果，有髓鞘神經(jīng)纖維可能與激痛點的病理過程存在聯(lián)系。
　　第二部分有髓鞘神經(jīng)纖維對激痛點相應(yīng)脊髓中樞敏化及神經(jīng)元形態(tài)的影響機制研究
　

14、　研究背景：
　　中樞敏化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外周刺激的過度反應(yīng)，是神經(jīng)性疼痛的共有機制。脊髓具有可塑性，持續(xù)傳人的外周傷害性刺激可以激活脊髓背角的神經(jīng)元，使脊髓背角發(fā)生重構(gòu)，如神經(jīng)纖維的出芽、神經(jīng)元表型轉(zhuǎn)變等，導致神經(jīng)元表達受體種類增多、原有神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，或開始表達新的神經(jīng)遞質(zhì)。上述改變可以造成外周傷害性刺激的感受閾增加，反應(yīng)強度提高，即中樞敏化。動物實驗中，谷氨酸受體的表達程度常作為判斷中樞敏化存在與否及衡量其敏化程度的指標。

15、
　　既往研究顯示，有髓鞘神經(jīng)纖維參與了炎癥及外傷引起的中樞敏化過程;亦有文獻提出，激痛點對應(yīng)的脊髓層面可能存在中樞敏化。在本研究第一部分中，我們發(fā)現(xiàn)激痛點處的有髓鞘神經(jīng)纖維數(shù)目明顯高于正常肌肉組織。而且之前的臨床試驗也證實了有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點的疼痛、自發(fā)性電位等特異性改變存在聯(lián)系。我們推測有髓鞘神經(jīng)纖維可能與激痛點的中樞敏化存在聯(lián)系。
　　此外，有學者采用辣根過氧化物(HRP)神經(jīng)示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)大鼠激痛點相應(yīng)脊髓背根神經(jīng)

16、節(jié)中的感覺神經(jīng)元有數(shù)量減少、平均體積減小的趨勢。但尚無關(guān)于激痛點相應(yīng)脊髓背角神經(jīng)元的報道。我們首次選用了霍亂毒素亞單位結(jié)合的辣根過氧化物酶(CB-HRP)，一種可特異性追蹤有髓鞘神經(jīng)纖維的神經(jīng)示蹤劑，來研究激痛點相關(guān)脊髓背角的中間神經(jīng)元及脊髓腹角的運動神經(jīng)元，同時判定其改變是否與有髓鞘神經(jīng)纖維有關(guān)聯(lián)。
　　既往臨床試驗獲得的多為易受到主觀影響的間接證據(jù)（VAS痛覺指數(shù)等），中樞層面的形態(tài)學改變等客觀證據(jù)無法得到。為了進一步深入研究

17、有髓鞘神經(jīng)纖維在激痛點病理過程中所發(fā)揮的作用，并獲得更直接的證據(jù)支持，我們采用大鼠為研究對象，觀察激痛點、河豚毒素特異性阻滯有髓鞘神經(jīng)纖維后的激痛點對應(yīng)的脊髓層面的中樞敏化情況及脊髓腹角、背角神經(jīng)元大小、數(shù)目的改變，并分別與正常組織對應(yīng)的脊髓層面進行比較。
　　目的：
　　1.研究有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點中樞敏化之間的聯(lián)系。
　　2.研究有髓鞘神經(jīng)纖維與激痛點對應(yīng)脊髓神經(jīng)元大小、數(shù)目改變的聯(lián)系。
　　研究方法

18、>　　1.谷氨酸受體免疫組織化學實驗。
　　1)動物分組:24只確定存在股二頭肌自然形成的激痛點的Wistar雄性大鼠被隨機均分為激痛點組/生理鹽水組/河豚毒素組，另外8只確定不存在股二頭肌激痛點的Wistar雄性大鼠用作正常對照組。
　　2)實驗動物處理及取材:生理鹽水組和河豚毒素組:分別在激痛點處注入0.1ml生理鹽水/0.1ml1μM的河豚毒素，每24小時一次，共6次。最后一次注射操作24小時后，大鼠經(jīng)深度麻醉、多聚甲

19、醛心臟灌注固定，取激痛點對應(yīng)脊髓(L5)層面;經(jīng)后固定、梯度沉糖、OCT包埋、切片，制成8μm厚的脊髓橫切面冰凍切片。正常組和激痛點組:不做特殊處理，同樣制得脊髓L5段的冰凍切片。
　　3)免疫組化實驗:分別進行這4組脊髓切片的谷氨酸受體(mGluR1α/mGluR5/NMDAR1)相應(yīng)免疫組化實驗，測定其在脊髓背角的表達情況（陽性神經(jīng)元位置、陽性神經(jīng)元比率）。
　　4)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計:所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式表示。

20、對其進行正態(tài)分布分析后，選用單因素方差分析及Newman-Keuls Multiple Comparison Test后檢驗分析各組陽性神經(jīng)元率差異。若P＜0.05，認為差異具有統(tǒng)計學意義。2.CB-HRP神經(jīng)示蹤技術(shù)研究激痛點/非激痛點對應(yīng)脊髓層面神經(jīng)元。
　　1)動物分組:24只確定存在股二頭肌自然形成的激痛點的Wistar雄性大鼠被隨機均分為激痛點組/生理鹽水組/河豚毒素組，另外8只確定不存在股二頭肌激痛點的Wistar雄性

21、大鼠用作正常對照組。
　　2)動物處理:生理鹽水組和河豚毒素組:分別在激痛點處注入0.1ml生理鹽水/0.1 ml1μM的河豚毒素，每24小時一次，共6次。最后一次注射24小時后，在激痛點處以微量注射器注入20μlCB-HRP。正常組和激痛點組:在股二頭肌非激痛點處/激痛點處以微量注射器注入20μlCB-HRP。
　　3)取材:注入CB-HRP48小時后，大鼠深度麻醉，分別以生理鹽水、固定劑（由多聚甲醛、蔗糖、磷酸緩沖液配制

22、而成）、蔗糖行心臟灌注固定，取脊髓L5段，經(jīng)梯度沉糖、OCT包埋、切片，制成10μm厚的脊髓橫切面冰凍切片。
　　4)觀察被標記神經(jīng)元的位置分布;根據(jù)被標記神經(jīng)元位置及與疼痛的聯(lián)系，對脊髓背角諸板層的中間神經(jīng)元及脊髓腹角的運動神經(jīng)元，分別進行數(shù)量和平均直徑的分析。
　　5)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計:所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式來表示。對其進行正態(tài)分布分析后，選用單因素方差分析及Newman-Keuls Multiple Compa

23、rison Test后檢驗分析各組結(jié)果差異。若P＜0.05，認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.谷氨酸受體免疫組化實驗。
　　1)在4組結(jié)果中，mGluR1α/mGluR5/NMDAR1在脊髓背角的表達位置基本相同:mGluR1α位于脊髓背角深層（第Ⅲ-Ⅳ板層）、mGluR5多表達于第Ⅰ-Ⅱ板層、NMDAR1陽性神經(jīng)元可見于整個脊髓背角。
　　2)根據(jù)上述每個受體的表達部位分別進行陽性神經(jīng)元率檢測。針對

24、相同板層中特定受體:單因素方差分析結(jié)果顯示各組陽性神經(jīng)元率有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05):激痛點組、生理鹽水組的陽性神經(jīng)元率最高，河豚毒素組陽性神經(jīng)元率居中，正常組最低;Newman-Keuls Multiple Comparison Test后檢驗結(jié)果提示:在4組中，激痛點組和生理鹽水組二者無顯著差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均存在顯著差異(P＜0.05)。
　　2.CB-HRP神經(jīng)元標記。
　　1)在4組結(jié)果中

25、，可以在脊髓全層見到被CB-HRP標記為亮藍綠色的神經(jīng)元，其位置基本相同:脊髓背角第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ板層及第Ⅴ板層的外側(cè)1/3部分及脊髓腹角第Ⅸ板層標記神經(jīng)元最多。根據(jù)被標記神經(jīng)元所在位置與傷害性刺激的關(guān)系，對其進行具體定量分析。
　　2) CB-HRP神經(jīng)元直徑:對于脊髓背角第Ⅰ、Ⅳ板層、第Ⅴ板層（外1/3部分）、脊髓腹角第Ⅸ板層中的某一特定板層:單因素方差分析提示各組平均直徑有顯著差異(P＜0.05):激痛點組、生理鹽水組的標記神經(jīng)

26、元直徑最小，河豚毒素組居中，正常組最大;Newman-Keuls Multiple Comparison Test后檢驗結(jié)果提示激痛點組和生理鹽水組二者無顯著差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均存在顯著差異(P＜0.05)。
　　3) CB-HRP神經(jīng)元數(shù)目:對于脊髓背角第Ⅰ、Ⅳ板層、第Ⅴ板層外1/3部分中的相同部位，單因素方差分析結(jié)果顯示4組間有差異(P＜0.05):激痛點組、生理鹽水組的標記神經(jīng)元數(shù)目最少，河豚毒素組居中，

27、正常組最多，Newman-KeulsMultiple Comparison Test后檢驗結(jié)果提示激痛點組和生理鹽水組二者無顯著差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均存在顯著差異(P＜0.05)。對于脊髓腹角第Ⅸ板層:單因素方差分析結(jié)果顯示4組間有差異:正常組的標記神經(jīng)元數(shù)目最多，激痛點組、生理鹽水組河豚毒素組數(shù)目較少(P＜0.05)，Newman-Keuls MultipleComparison Test后檢驗結(jié)果提示:生理鹽水組、