鈣在低溫脅迫三尖杉過程中信號轉導機制研究.pdf

1、三尖杉是我國一級保護樹種，具有很高的藥用價值，但是現(xiàn)存的自然資源有限，天然更新又極其困難。目前主要集中在三尖杉酯堿抗癌性能研究較多，而對于三尖杉生理活性和生化特性了解甚少，因此研究三尖杉在低溫條件下的生理生化特性，探討提高植物抗寒性的理論與技術，將對三尖杉乃至其它木本植物的抗性育種提供理論基礎和技術指導。 Ca2+作為第二信使在生物體內起著重要的作用。而Ca2+信號對植物抗寒的作用大多數(shù)只是在一年生草本植物上得到研究，而以多年生

2、的木本植物的研究上甚少，本研究以一年生的三尖杉幼苗為材料，研究了低溫脅迫過程中鈣信號的作用機制以及為擴大三尖杉種植資源提供理論依據(jù)。主要研究結果如下： 1.隨著低溫脅迫時間的延長，低溫鍛煉和結合CaCl2處理細胞內鈣離子水平呈現(xiàn)迅速而又短暫的上升，之后恢復到靜息狀態(tài)。在低溫脅迫2min后，低溫鍛煉和結合CaCl2處理鈣離子濃度迅速上升，結合CaCl2處理上升幅度較單純低溫鍛煉快，由120nmol/l上升到885nmol/l,.之

3、后又恢復到靜息狀態(tài)基態(tài)值120nmol/l，低溫鍛煉由120nmol/l上升到650nmol/l。而EGTA、LaCl3、CPZ完全抑制了不親和互作過程中細胞內的[Ca2+]的升高，因為LaCl3是質膜Ca2+通道的抑制劑，所以[Ca2+]cyt的升高來源于外部的Ca2+，通過質膜Ca2+通道的開放流入細胞質。EGTA是一種質膜上電壓依賴型(L型)Ca2+通道抑制劑，所以三尖杉葉片質膜上的Ca2+通道為電壓依賴型Ca2+通道，同時也說明

4、在低溫脅迫過程中，細胞內鈣離子濃度變化是傳遞低溫信息的前期信號。 2.隨著低溫脅迫時間的延長，單純低溫、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理葉片中CaM含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，并且結合CaCl2處理在整個脅迫過程中CaM含量均顯著高于其它各個處理。在低溫脅迫72h時，鈣調素含量達到最大，EGTA、LaCl3、CPZ、單純低溫鍛煉和正常情況下生長的三尖杉葉片中鈣調素含量分別比CaCl2處理降低了74.4％、33.

5、92％、37.5％、53.7％和86.3％，CaM含量的上升增強了植物的抗冷性。這表明Ca2+-CaM信使系統(tǒng)參與了低溫脅迫三尖杉信號轉導，通過Ca2+-CaM復合體的形成傳遞信號，激活各種酶活性，增強了植物體抗冷性，減緩了低溫對三尖杉的傷害。 3.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理幼苗，研究了低溫脅迫過程中植物體內保護酶活性的變化。結果表明：隨著低溫脅迫時間的延長，單純低溫、

6、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理葉片中CAT、POD、SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。但結合CaCl2處理明顯提高植物體CAT、POD、SOD活性，而且保護酶活性下降也較緩慢；EGTA、LaCl3、CPZ處理則抑制了植物體內保護酶活性的上升，說明Ca2+-CaM信使系統(tǒng)作為低溫脅迫過程中的信號分子參與低溫脅迫三尖杉幼苗的信號轉導。Ca2+通過形成Ca2+-CaM復合體來激活各種生理生化反應，減緩了低溫對植物體的傷害，提

7、高植物體抗性。而EGTA、CPZ和LaCl3通過抑制Ca2+-CaM的形成使三尖杉幼苗體內活性酶活性下降，并呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，加劇了低溫對三尖杉幼苗的傷害。 4.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理幼苗，研究了低溫脅迫過程中植物體內O2-產(chǎn)生速率的變化。結果表明：隨著低溫脅迫時間的延長，單純低溫鍛煉和結合CaCl2處理，均呈現(xiàn)先上升后下降，結合CaCl2處理減緩了O2-產(chǎn)生速率

8、；而CPZ、EGTA和LaCl3處理則增加了O2-產(chǎn)生的速率，這可能是Ca2+-CaM信使系統(tǒng)調控低溫信號轉導，提高植物體抗冷性的生理基礎之一。 5.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、EGTA、LaCl3、CPZ處理幼苗，研究了低溫脅迫過程中植物體內H2O2的含量的變化。結果表明：隨著低溫脅迫時間的延長，單純低溫鍛煉幼苗過氧化氫含量呈先下降后上升的變化趨勢，變化幅度較大。結合CaCL2處理H2O2含量隨呈現(xiàn)上

9、升趨勢，但是升趨勢緩慢，始終低于LaCl3、CPZ、EGTA處理，說明Ca2+有可能通過降低植物體內H2O2的含量，來維持植物體的正常生長。 6.從三尖杉葉片中的蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE電泳可以看到，在葉面噴施CaCL2經(jīng)低溫脅迫10、30、180、360、540、720、1440min后均明顯出現(xiàn)了一條66KD的蛋白譜帶，而且表達水平很高，在噴后540min時表達量開始下降，到720min與1440min時同樣的分子量的蛋

10、白譜帶則變的不是很明顯。在上樣液中加入EGTA時，幾乎完全阻止了蛋白的表達量，而加入Ca2+則增加了蛋白質的表達量。為了進一步檢測該蛋白激酶活性的變化，通過放射自顯影法證明，在66KD蛋白譜帶的相應部位將凝膠中鑲嵌的底物HIS-Ⅲ進行了磷酸化，又由于鈣依賴蛋白激酶家族分子量約為40-90KD,因此推斷該蛋白激酶為鈣依賴蛋白激酶家族。 7.以一年生的三尖杉幼苗為材料，分別以H2O、CaCl2、HHT、HHT+EGTA處理幼苗，研究