外周血CD34+細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)修復兔顱骨缺損的實驗研究.pdf

1、顱骨缺損是顱頜面外科及整形外科面臨的常見問題,其形成原因有腦外傷、顱內(nèi)腫瘤及腦血管意外手術等。大面積顱骨缺損的患者容易罹患一系列神經(jīng)癥狀,如頭痛、眩暈、易激惹、記憶力下降、抑郁等,臨床上稱之為顱骨缺損綜合征,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。并且,失去顱骨保護的腦組織易于受到外力的傷害,缺損顱骨還會給患者帶來嚴重的美觀問題。因此,如何修復缺損的顱骨成為臨床工作者必需解決的一個重要問題。
　　傳統(tǒng)的治療顱骨缺損方法包括自體骨及同種異體骨移植等

2、,存在明顯的缺陷。組織工程骨技術的發(fā)展為顱骨缺損修復提供了新的思路。組織工程骨的概念包括了種子細胞、支架材料和細胞因子三要素。其中,遴選優(yōu)秀的種子細胞是構(gòu)建組織工程骨的前提和基礎。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)是目前應用最為廣泛的種子細胞,其成骨能力在一系列體外及體內(nèi)實驗研究中已得到證實。但是,BM-MSC也存在一些缺點,尤其是促進新血管發(fā)生的作用不明顯,不利于修復大面積的骨缺損。
　　外周血CD34+(PB-CD34+)

3、細胞是包含造血干細胞(HSC)和內(nèi)皮祖細胞(EPC)等細胞成分的混合細胞群。近年來,PB-CD34+促進新生血管發(fā)生的作用已被多個實驗所證實。并且,PB-CD34+細胞還可以向成骨細胞分化并促進新骨的形成。因此我們推測,可否將PB-CD34+細胞與BM-MSC進行共培養(yǎng),構(gòu)建以PB-CD34+細胞為輔助細胞,BM-MSC為目的細胞的共培養(yǎng)體系?共培養(yǎng)所得細胞的生物學特性,尤其是體外及體內(nèi)成骨能力如何?共培養(yǎng)細胞能否做為一種新的種子細胞應

4、用于臨床?為了回答這些問題,本研究首先建立PB-CD34+細胞與BM-MSC共培養(yǎng)體系,并通過一系列的體外、體內(nèi)實驗驗證共培養(yǎng)細胞能否做為一種新型的種子細胞用于組織工程骨的構(gòu)建。
　　研究目的
　　1.分離PB-CD34+細胞及BM-MSC,建立以PB-CD34+細胞為輔助細胞,BM-MSC為目的細胞的共培養(yǎng)體系。
　　2.探討共培養(yǎng)細胞的生物學特性,尤其是體外及體內(nèi)成骨能力,并將共培養(yǎng)細胞與單純BM-MSC的成骨能力

5、做一對比。
　　3.應用共培養(yǎng)細胞膜片復合羥基磷灰石(HA)支架材料修復兔顱骨極限缺損模型,探討共培養(yǎng)細胞的臨床應用前景。
　　研究方法
　　1.應用流式細胞儀分選兔PB-CD34+細胞;應用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離BM-MSC,并利用流式細胞技術檢測所得細胞的表面分子表達,克隆集落形成、MTT法檢測細胞增殖,并進行成骨、成脂及成神經(jīng)誘導,從而鑒定所得細胞為BM-MSC;最后以直接接觸方式對PB-CD34+細胞及

6、BM-MSC進行共培養(yǎng),建立共培養(yǎng)體系,并檢測共培養(yǎng)細胞的構(gòu)成。
　　2.對共培養(yǎng)細胞的生物學特性進行分析:檢測細胞周期及凋亡,檢測細胞體外成骨能力,對細胞進行成膜誘導,將細胞膜片復合HA進行裸鼠體內(nèi)移植,檢測細胞體內(nèi)成骨能力,以上檢測項目均設計與單純BM-MSC進行比較、對照。
　　3.建立兔顱骨極限缺損模型。分別利用共培養(yǎng)細胞及單純BM-MSC細胞膜片復合HA進行修復。術后8周處死動物,分別通過影像學、組織學及分子生物學

7、檢測手段比較兩種方法的修復效果。
　　實驗結(jié)果
　　1.應用流式細胞儀分選可以得到 PB-CD34+細胞,分選率為0.8％。分離所得的BM-MSC,以流式細胞儀鑒定其高表達間充質(zhì)干細胞標志物,不表達造血系干細胞標志物;通過克隆形成實驗及MTT法檢測細胞增殖能力,證實分離細胞具有自我更新能力;通過成骨、成脂及成神經(jīng)分化實驗,證實了分離細胞具有多向分化能力。共培養(yǎng)體系建立,該體系中既包括大量的BM-MSC,也包括貼壁生長的PB-

8、CD34+細胞。
　　2.將共培養(yǎng)細胞的生物學特性與單純BM-MSC相比較:流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)細胞具有更高的增殖能力和相對少的早期凋亡率;體外及體內(nèi)成骨能力檢測發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)細胞的成骨能力更強。
　　3.移植共培養(yǎng)細胞及單純BM-MSC細胞膜片復合HA修復兔顱骨極限缺損模型發(fā)現(xiàn):活體常規(guī)CT及術后所取顱骨標本micro-CT掃描顯示,共培養(yǎng)細胞組實驗動物的修復效果較好;組織學檢測及定量分析顯示,共培養(yǎng)細胞

9、組新生的骨小梁體積及新生骨修復缺損比率均高于單純BM-MSC組;實時定量PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)細胞組缺損修復區(qū)成骨及促血管生成相關因子的表達量高于單純BM-MSC組。
　　結(jié)論
　　1.通過將PB-CD34+細胞與BM-MSC以直接接觸方式共培養(yǎng),可以建立一種特殊的共培養(yǎng)細胞體系。
　　2.共培養(yǎng)細胞具有比單純BM-MSC更強的體外及體內(nèi)成骨能力。
　　3.應用共培養(yǎng)細胞修復兔顱骨極限缺