Ad5-F35-APE1 siRNA重組腺病毒聯(lián)合光動(dòng)力療法對(duì)非小細(xì)胞肺癌治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤死因的首位，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前對(duì)肺癌的治療方法有手術(shù)、放療和化療等，盡管這些治療手段技術(shù)上均有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是由于肺癌發(fā)生的分子機(jī)制及病理過程較為復(fù)雜，其5年生存率無明顯提高，因此亟待探索新的肺癌治療手段。光動(dòng)力治療(photodynamictherapy，PDT)是一種在有氧條件下，通過一定波長(zhǎng)的激光激發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)光敏劑產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(reactiveoxygenspeci

2、es，ROS)直接損傷腫瘤細(xì)胞、使微血管受損造成癌組織血流灌注減少的抗腫瘤新方法。但由于腫瘤細(xì)胞可能對(duì)其治療過程中的氧化損傷及DNA損傷均具有一定的自身修復(fù)作用，影響了PDT對(duì)腫瘤的療效。脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinicapyrimidinicendonuclease，APE1)具有DNA損傷修復(fù)和氧化還原雙功能，能通過調(diào)節(jié)生物體對(duì)氧化應(yīng)激和缺氧的適應(yīng)性，最大限度地減少細(xì)胞損傷。本研究以APE1為靶點(diǎn)，通過Ad5/F35-AP

3、E1siRNA重組腺病毒，研究其體內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞感染效率和對(duì)APE1基因表達(dá)的“敲除”作用，及其體內(nèi)及體外增強(qiáng)肺癌PDT敏感性的作用及機(jī)制。 研究目的： 1.探討APE1在非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcarcinomas，NSCLC)中的表達(dá)特點(diǎn)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC以APE1靶點(diǎn)的基因治療提供臨床理論依據(jù)； 2.探討以APE1為靶點(diǎn)的基因治療聯(lián)合PDT在肺癌治療中的臨床應(yīng)用前景

4、。 研究?jī)?nèi)容和方法： 1.APE1在NSCLC組織中表達(dá)及其臨床意義：采用免疫組化方法檢測(cè)NSCLC組織APE1蛋白表達(dá)特點(diǎn)，分析APE1表達(dá)高低與預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步以APE1為靶點(diǎn)的基因治療提供臨床病理基礎(chǔ)。 2.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對(duì)A549細(xì)胞殺傷效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒對(duì)A549細(xì)胞感染效率；Westernblot檢

5、測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞APE1基因的沉默作用；采用[γ-32P]ATP標(biāo)記寡核苷酸法檢測(cè)Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒對(duì)A549細(xì)胞AP內(nèi)切酶活性的抑制作用；通過MTT來檢測(cè)PDT及Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制作用；流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡；彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷；Westernblot檢測(cè)APE1蛋白及VEGF蛋白的表達(dá)。 3.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)

6、合PDT對(duì)A549細(xì)胞裸鼠移植瘤抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究：建立肺腺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，觀察Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對(duì)肺癌生長(zhǎng)抑制的協(xié)同作用，TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡。 研究結(jié)果： 1.APE1在NSCLC組織表達(dá)及其臨床意義：正常肺組織及NSCLC組織均有APE1表達(dá)，但其表達(dá)的定位有所區(qū)別，正常肺組織以胞核表達(dá)為主，NSCLC組織以胞漿表達(dá)為主，兩者之間差異性顯著(P＜0.

7、01)；通過Kaplan-Meier生存分析提示：APE1高低表達(dá)組之間生存時(shí)間有顯著性差異，APE1低表達(dá)組中位生存時(shí)間為35±5.196個(gè)月，APE1高表達(dá)組中位生存期為26±0.761個(gè)月。 2.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒對(duì)A549細(xì)胞生物效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究：10MOI的Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒對(duì)A549細(xì)胞的感染效率可達(dá)98％；Ad5/F35-APE1siRNA呈劑量依賴性地抑制A549細(xì)胞

8、APE1蛋白表達(dá)，且能顯著抑制A549細(xì)胞的AP內(nèi)切酶活性。 3.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒增強(qiáng)A549細(xì)胞PDT治療敏感性及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究：Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合PDT能顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞的增殖抑制作用；Ad5/F35-APE1siRNA增加PDT誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡；堿性彗星分析結(jié)果顯示Ad5/F35-APE1siRNA抑制PDT后A549癌細(xì)胞DNA修復(fù)能力；PDT可誘導(dǎo)A549細(xì)胞A

9、PE1及VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)，但通過Ad5/F35-APE1siRNA可抑制A549細(xì)胞PDT誘導(dǎo)的APE1及VEGF蛋白的表達(dá)。 4.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對(duì)A549細(xì)胞裸鼠移植瘤抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ad5/F35-APE1siRNA+PDT組腫瘤生長(zhǎng)較單純PDT組明顯被抑制，單純Ad5/F35-APE1siRNA組腫瘤抑制率為34.85％，單純PDT組腫瘤抑制率為52.19％，

10、Ad5/F35-APE1siRNA+PDT組腫瘤抑制率為93.97％。TUNEL檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況，顯示Ad5/F35-APE1siRNA+PDT組腫瘤細(xì)胞凋亡率為(24.68±2.47)％，顯著高于Ad5/F35-APE1siRNA感染組(6.24±1.32)％、單獨(dú)PDT組(12.12±1.76)％以及對(duì)照組(3.37±1.28)％(p＜0.01)。 結(jié)論： 1.APE1在NSCLC中有胞漿異位表達(dá)的傾向，且APE

11、1表達(dá)的高低與肺癌的預(yù)后有關(guān)。 2.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒容易感染肺腺癌A549細(xì)胞，且可特異性抑制A549細(xì)胞APE1蛋白表達(dá)，抑制A549細(xì)胞的AP內(nèi)切酶活性。 3.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒能顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞PDT敏感性，主要是通過兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，一方面通過抑制A549細(xì)胞PDT后的DNA損傷修復(fù)能力；另一方面通過抑制A549細(xì)胞對(duì)PDT所致氧化損傷的修復(fù)能力。