鼻咽癌患者細(xì)胞免疫功能及Ad5F35-LMP2重組腺病毒疫苗的研究.pdf

1、本研究的目的是在初步了解鼻咽癌患者EB病毒相關(guān)細(xì)胞免疫情況下，構(gòu)建Ad5F35-LMP2非復(fù)制型重組腺病毒，并檢測其免疫效果。首先我們采用熒光定量PCR方法檢測NPC患者、EBV-VCA-IgA陽性和正常人對照組三組人群血清EBV-DNA，免疫酶法檢測EBV-VCA-IgA抗體，ELISPOT方法檢測外周血中EBV-LMP2特異性CTL反應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T細(xì)胞亞群、CD4<'+>CD25<'+>細(xì)胞比率，結(jié)果顯示在NPC患者血清

2、中的EBV-DNA與另二組人群血清中EBV-DNA無論在陽性率還是在定量上都具有顯著性差異，且EBV-DNA水平在NPC患者中進(jìn)展期明顯高于病程早期；血清中EBV-VCA-IgA的效價在NPC組和EBV-VCA-IgA陽性人群之間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義；EBV-LMP2特異性CTL反應(yīng)在健康對照組呈現(xiàn)較高的反應(yīng)，EBV-VCA-IgA陽性人群次之，NPC病人最低，且鼻咽癌患者細(xì)胞免疫功能及Ad5F35-LMP2重組腺病毒疫苗的研究EBV-L

3、MP2特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)陽性率與血清中EBV-DNA載量相關(guān)；晚期鼻咽癌患者外周血CD3<'+>、CD4<'+>細(xì)胞亞群數(shù)量低于正常人，CD4<'+>CD25<'+>細(xì)胞比率高于正常人；74％NPC病人LMP2抗體陽性，EBV-VCA-IgA陽性人群和健康對照組均未檢測到LMP2抗體。接著，我們以EBV-LMP2為靶基因，構(gòu)建了Ad5F35-LMP2的復(fù)制缺陷型重組腺病毒疫苗作為NPC等EB病毒相關(guān)腫瘤的免疫疫苗。我們將EB病毒LMP2

4、基因插入穿梭質(zhì)粒PDC316中，使用Admax系統(tǒng)通過脂質(zhì)體將穿梭質(zhì)粒PDC316和腺病毒骨架質(zhì)粒導(dǎo)入293細(xì)胞中使病毒得到包裝。經(jīng)體外感染293細(xì)胞，將病毒上清進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果證實病毒DNA中含有目的基因的特異性片段。RT-PCR證明了外源基因在真核細(xì)胞中得以轉(zhuǎn)錄，免疫酶的結(jié)果也顯示LMP2蛋白在真核細(xì)胞得到有效表達(dá)。 為初步探討其免疫效果，將Ad5F35-LMP2重組腺病毒肌肉注射靈長類動物恒河猴，分高(1.5×10<'

5、10>TCID50/只)、中(1.5×10<'9>TCID50/只)、低(1.5×10<'8>TCID50/只)和PBS對照4組進(jìn)行免疫，每組4只。每1個月加強免疫1次，共免疫3次，分別于免疫前(0周)和免疫后第4、8、12周采集猴外周血。分離猴子外周血淋巴細(xì)胞及血清，ELISPOT方法檢測抗LMP2的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫酶法檢測LMP2的特異性抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個劑量組的猴子都可以產(chǎn)生針對LMP2的特異性細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，且隨著免

6、疫病毒次數(shù)和劑量增多，產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答的猴子數(shù)量增多，反應(yīng)增強，高劑量組免疫后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答比低劑量組高，誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的高低與免疫劑量之間存在一定的依賴關(guān)系，其中，給予高病毒劑量免疫的恒河猴，1×10<'6>個外周血單個核細(xì)胞中，經(jīng)LMP2多肽刺激后釋放細(xì)胞因子IFN-γ的細(xì)胞數(shù)最高可達(dá)650個。EBV-LMP2特異性抗體在疫苗初次免疫4周時開始產(chǎn)生，第8～1 2周時抗體的滴度較高。用PBS作為對照組的恒河猴則沒有引起相應(yīng)的免疫反應(yīng)。

7、為了解重組腺病毒體外感染的DC是否能夠活化特異性的CTL，我們首先進(jìn)行了體外試驗。在體外試驗中，我們選擇的志愿者是與CNE-2細(xì)胞有著相同的HLA-All型別的正常人，分離外周血單個核細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)并用LMP2重組腺病毒感染樹突狀細(xì)胞(DC)后活化鼻咽癌患者細(xì)胞免疫功能及Ad5F35-LMP2重組腺病毒疫苗的研究自身的T細(xì)胞，然后按一定比例將CTL細(xì)胞加入到前一天接種的CNE-2細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后采用MTT法檢測CNE-2細(xì)胞的增殖

8、，結(jié)果顯示LMP2重組腺病毒修飾的DC與無關(guān)基因重組腺病毒修飾的DC相比，其體外活化的CTL可以在體外有效抑制CNE-2腫瘤細(xì)胞的生長，效靶比為20：1時，其抑制率分別是46.59％和28.30％；接著我們還進(jìn)行了體內(nèi)抑制腫瘤生長的試驗。SCID小鼠經(jīng)人外周血單個核細(xì)胞懸液注射后，再分別用Ad5F35-LMP2-DC及未轉(zhuǎn)染DC腹腔注射免疫，末次免疫7天后用1×10<'6>的CNE-2腫瘤細(xì)胞接種于小鼠皮下，觀察小鼠體內(nèi)腫瘤生長情況，第

9、4周處死小鼠，取腫瘤稱重并作病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示Ad5F35-LMP2-DC組腫瘤的潛伏期明顯延長，CNE-2陽性對照組和未修飾DC組小鼠1周左右就出現(xiàn)了腫瘤，而Ad5F35-LMP2-DC組則直到2周后才出現(xiàn)腫瘤；且腫瘤體積較小，重量較輕，平均腫瘤抑制率為89.18％。總之，鼻咽癌患者細(xì)胞免疫功能降低，血清EBV-DNA升高。我們構(gòu)建的Ad5F35-LMP2重組腺病毒可以在動物體內(nèi)成功誘導(dǎo)LMP2特異性細(xì)胞和體液反應(yīng)；Ad5F35-L