聚醚砜膜對(duì)AST生物學(xué)行為的影響及ACM對(duì)缺氧與機(jī)械損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用.pdf

1、前言 星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)主要的膠質(zhì)細(xì)胞成分之一，在CNS的發(fā)育和再生中起著十分重要的作用。研究表明在正常和活化狀態(tài)下，AST可分泌包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在內(nèi)的細(xì)胞因子多達(dá)100余種。其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)等。有研究表明，NGF可明顯減輕創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞的死亡及凋亡，這與其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用相關(guān)。在神經(jīng)損傷后，BDNF可通過(guò)某些機(jī)制對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。研究發(fā)

2、現(xiàn)，單一神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用比較局限，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的多因子協(xié)同的一個(gè)很好的手段就是利用生物反應(yīng)器，利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)AST分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，通過(guò)一系列方法濃縮培養(yǎng)濾液，將可能獲得含多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的混合液。利用聚醚砜(polyethersulfone，PES)半透膜構(gòu)建的生物反應(yīng)器培養(yǎng)肝細(xì)胞已有成功的經(jīng)驗(yàn)，但培養(yǎng)AST是否可行，對(duì)AST形態(tài)、增殖能力與功能的影響如何也無(wú)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。 研究發(fā)現(xiàn)，AST的條件培養(yǎng)液(Astro

3、cyte-conditioned medium，ACM)中含有多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分，包括NGF和BDNF等細(xì)胞活性成分，提示ACM可能具有促進(jìn)損傷神經(jīng)元存活與功能恢復(fù)的作用。CNS損傷后的病理生理改變多伴有腦缺血、缺氧，而神經(jīng)細(xì)胞的缺氧性損傷是一個(gè)啟動(dòng)神經(jīng)毒性的循序的級(jí)聯(lián)損傷反應(yīng)。在這個(gè)過(guò)程中，一氧化氮(NO)起了很大作用，大量產(chǎn)生的NO可介導(dǎo)谷氨酸激活NMDA受體加重神經(jīng)元的損害；過(guò)量合成的NO也可損傷線粒體的電子傳遞系統(tǒng)，抑制能量代謝及

4、DNA合成。乳酸脫氫酶(LDH)，作為細(xì)胞內(nèi)的一種標(biāo)志酶，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，LDH釋放量明顯增加，因此，通常以LDH在細(xì)胞液中的透過(guò)量作為衡量神經(jīng)元的損傷程度和細(xì)胞膜通透性的指標(biāo)之一。腦缺血缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡或凋亡。腦缺血缺氧首先造成神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝障礙，導(dǎo)致ATP的耗竭。機(jī)械性損傷模型與創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)病機(jī)制最相似，外傷致腦缺血缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡或凋亡。 目的 研究體外培養(yǎng)小鼠AST增殖及其分

5、泌NGF和BDNF的規(guī)律，以及聚醚砜膜對(duì)AST生長(zhǎng)、存活增殖及分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響；通過(guò)體外細(xì)胞模型，研究體外培養(yǎng)的小鼠ACM對(duì)缺氧、機(jī)械損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。 方法 1、取新生KM小鼠的皮層進(jìn)行AST純化培養(yǎng)。原代培養(yǎng)時(shí)，分為普通培養(yǎng)板組和聚醚砜膜組，在培養(yǎng)的第1、3、5、7、9(天)用CCK-8試劑盒測(cè)定、比較兩組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)。同法測(cè)定AST在傳第一代后不同時(shí)間點(diǎn)(第1、3、7、14、21天)，及傳第1

6、至6代每代的第5天的細(xì)胞數(shù)，用ELISA試劑盒測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)ACM中NGF和BDNF的含量，得出變化趨勢(shì)。 2、AST傳代純化培養(yǎng)后分為三組：A普通培養(yǎng)板組、B聚醚砜膜組、C層粘連蛋白包被膜組，觀察和比較細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活增殖能力的變化，同時(shí)測(cè)定并比較不同處理組別問(wèn)培養(yǎng)基中NGF、BDNF含量。 3、體外分離培養(yǎng)KM小鼠皮層神經(jīng)元，取傳代培養(yǎng)第三代第5天的不同濃度的ACM作用于正常培養(yǎng)神經(jīng)元，在ACM作用3天、6天后，用

7、CCK8法分別測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，觀察ACM的濃度變化對(duì)神經(jīng)元存活的影響。 4、通過(guò)三氣培養(yǎng)箱缺氧處理建立神經(jīng)元缺氧損傷模型，采用微量移液器塑料滴頭機(jī)械性劃割培養(yǎng)之神經(jīng)細(xì)胞建立神經(jīng)元機(jī)械損傷模型；把20％ACM分別加入到缺氧/復(fù)氧損傷及機(jī)械損傷的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液中，測(cè)定ACM對(duì)缺氧及機(jī)械損傷神經(jīng)元的存活及采用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)其合成和釋放。NO、LDH的變化，對(duì)缺氧損傷神經(jīng)元同時(shí)檢測(cè)胞膜ATP酶(ATPase)活性的變化，籍以

8、探討ACM對(duì)缺氧及機(jī)械損傷神經(jīng)元保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。 結(jié)果 1、在原代培養(yǎng)時(shí)，兩組細(xì)胞都表現(xiàn)為持續(xù)的增殖，聚醚砜膜組第3天、5天、7天的細(xì)胞OD值較普通培養(yǎng)板組明顯低(P<0.05)。傳代培養(yǎng)后，三組細(xì)胞增殖變化趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)為持續(xù)快速增殖，到第7天達(dá)到高峰，以后細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間逐漸減少。比較傳代后各代細(xì)胞第5天的細(xì)胞數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)第1代、2代、3代細(xì)胞表現(xiàn)為輕度上升，第3代后表現(xiàn)為減少，但第1至第5代相鄰代問(wèn)細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯

9、差異，第6代(0.32±0.032)比第5代(0.376±0.039)明顯下降(P<0.05)。 2、與常規(guī)培養(yǎng)的A組相比，生長(zhǎng)在PES膜上的B組細(xì)胞胞體略小，胞核清晰，突起較短，GFAP免疫熒光染色顯示其GFAP表達(dá)較培養(yǎng)在蓋玻片上的AST明顯增強(qiáng)。而C組的AST細(xì)胞與B組細(xì)胞比較，細(xì)胞胞體伸展，突起明顯，免疫熒光染色顯示GFAP表達(dá)較弱，與A組相近。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線看，培養(yǎng)第3天后(第3、7、14、21天)B組細(xì)胞數(shù)(0.21

10、5±0.026、0.302±0.075、0.150±0.031、0.135±0.015)較A組、C組減少(P<0.05)，A組與C組在第1天、3天、7天細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。在傳代培養(yǎng)期，三組的細(xì)胞分泌NGF和BDNF的量與能力也呈相似的變化趨勢(shì)。用各組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的NGF和BDNF分泌量與相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)OD值比較，代表單位細(xì)胞的分泌能力，結(jié)果傳代培養(yǎng)的第7天的細(xì)胞分泌NGF和BDNF能力最強(qiáng)，第14天后單位細(xì)胞的分泌能力明顯

11、下降。而在組間比較發(fā)現(xiàn)B組的單位細(xì)胞分泌NGF和BDNF能力較A、C兩組低，以第7～14天明顯。 3、在ACM作用3天和6天后，10％ACM組(0.145±0.079/0.206±0.083)和20％ACM組的OD值(0.187±0.074/0.210±0.077)明顯高于正常完全培養(yǎng)基組(0.125±0.067/0.150±0.066)和50％ACM(0.134±0.034/0.145±0.034)和70％ACM組(0.075

12、±0.035/0.085±0.020)，差異明顯(P<0.05)，而ACM作用6天后10％ACM組和20％ACM組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。 4、用含20％ACM培養(yǎng)基作用于不同缺氧復(fù)氧時(shí)間的神經(jīng)元細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)基(低糖)培養(yǎng)的缺氧神經(jīng)元隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢(shì)，缺氧24小時(shí)細(xì)胞數(shù)(H24RO：0.048±0.004、H24R24：0.039±0.010)下降明顯，與缺氧8h(H8RO：0.063±0.006、H8

13、R24：0.058±0.011)比顯著下降(P<0.05)。而各缺氧時(shí)間再?gòu)?fù)氧后細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)再下降，H8R0與H8R24；H24RO與H24R24組間均有明顯差異。加入20％ACM培養(yǎng)基后神經(jīng)元在各時(shí)間點(diǎn)(除外H4R24)的OD值(H4RO：0.076±0.012、H8RO：0.074±0.013、H8R24：0.063±0.010、H24RO：0.055±0.011、H24R24：0.046±0.013)較對(duì)照組(H4RO：0.0

14、76±0.012、H8RO：0.063±0.006、H8R24：0.058±0.011、H24RO：0.048±0.004、H24R24：0.039±0.010)升高，差異顯著(P<0.05)。 與對(duì)照組相比，20％ACM作用的缺氧神經(jīng)元，在H4R24、H8R0、H8R24、H24R0、H24R24各組的NO值均有明顯下降；而LDH釋放比則在H8R0、H8R24、H24R0、H24R24各時(shí)間點(diǎn)值也有明顯降低；ATPase則表現(xiàn)

15、為在H4R24、H8R0、H8R24、H24R0、H24R24有明顯增高，均P<0.05。 5、在神經(jīng)元機(jī)械損傷模型中，傷后1h兩組細(xì)胞數(shù)已開(kāi)始下降，隨時(shí)間推移繼續(xù)減少。損傷組間對(duì)比，隨損傷程度加重細(xì)胞數(shù)隨之下降，在傷后6h和24h更加明顯。與常規(guī)培養(yǎng)基組對(duì)比，加入20％ACM后，各損傷組傷后細(xì)胞數(shù)明顯多于常規(guī)培養(yǎng)基組(P<0.05)，這種變化在中重型損傷組傷后1小時(shí)即能看到，6到24小時(shí)后更加明顯。測(cè)定NO及LDH的變化，在傷

16、后lh，損傷組NO和LDH即開(kāi)始上升，6h、24h后更加明顯；加入20％ACM培養(yǎng)6h、24h后，NO的濃度(μmol/L)(1.632±0.423、3.293±0.427)明顯比常規(guī)培養(yǎng)基組(2.658±0.445、4.017±0.395)減低，P<0.05；而LDH濃度(U/L)則在傷后1h、6h、24h的損傷組都比常規(guī)培養(yǎng)基組明顯下降(P<0.05)。 結(jié)論 1、傳代后連續(xù)培養(yǎng)的AST細(xì)胞數(shù)持續(xù)增長(zhǎng)至第7天，后細(xì)胞

17、數(shù)下降；不斷傳代的AST，在第6代后細(xì)胞增殖能力開(kāi)始明顯下降； 2．聚醚砜膜對(duì)AST的存活增殖有一定抑制作用，并降低AST分泌NGF和BDNF的能力，層粘連蛋白在一定程度上可減輕聚醚砜膜對(duì)AST功能的抑制作用； 3．ACM對(duì)正常和缺氧神經(jīng)元的存活均有一定促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與減少NO、LDH合成與釋放，并保護(hù)和提高細(xì)胞膜上ATPase的活性有關(guān)； 4．ACM對(duì)機(jī)械損傷神經(jīng)元的存活同樣具有一定的促進(jìn)和保護(hù)作用，減少