人結(jié)腸癌CW-2干細(xì)胞的分離純化和生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：分選、培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2干細(xì)胞。比較3種細(xì)胞分選方法對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2干細(xì)胞的富集效率，探討獲得腫瘤干細(xì)胞的有效方法。探討人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2干細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　 方法：采用單純無(wú)血清懸浮培養(yǎng)、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑+流式細(xì)胞分選術(shù)（多重聯(lián)合）分別對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)。然后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、體內(nèi)NOD-SCID小鼠致瘤實(shí)驗(yàn)和體外Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

2、比較3種方法的富集效率。選擇較為有效的分離方法富集人結(jié)腸癌CW-2干細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)富集前后細(xì)胞中CD44+EPCAM+細(xì)胞含量、細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)、免疫組化檢測(cè)移植瘤中CD44和EPCAM細(xì)胞的表達(dá)情況和移植瘤H&E染色對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究。
　　 結(jié)果：人結(jié)腸癌CW-2細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中僅少部分存活并增殖形成懸浮的腫瘤干細(xì)胞球。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)+奧沙

3、利鉑處理細(xì)胞和多重聯(lián)合分選后細(xì)胞中具有結(jié)腸癌干細(xì)胞特性的CD44+EPCAM+細(xì)胞的含量分為57.39％、73.85％、89.57％；分別測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)（4、7、9、14、21、28d）各組小鼠成瘤情況，多重聯(lián)合分選細(xì)胞接種NOD-SCID小鼠后成瘤時(shí)間早、瘤體增長(zhǎng)速度快，接種后第4、7、9、14、21、28d體積分別為（209.25±31.54）mm3、（500.00±72.90）mm3、（852.75±157.51）mm3、（228

4、0.004±440.91）mm3、（4897.00±1154.15）mm3、（11070.00±3559.86）mm3，與無(wú)血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑處理細(xì)胞的成瘤能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純無(wú)血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑處理細(xì)胞和多重聯(lián)合分選后細(xì)胞接種72h后穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為（98±7）個(gè)/視野、（135±7）個(gè)/視野、（188±6）個(gè)/視野，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0

5、5）。故3種分選方法所獲得細(xì)胞中干細(xì)胞含量由高到低為：多重聯(lián)合分選后細(xì)胞、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑處理細(xì)胞、單純無(wú)血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。CD44+EPCAM+細(xì)胞球在含血清培養(yǎng)液中易分化為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，CD44+EPCAM+細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞占86.19％，G2+S期細(xì)胞占13.81％，傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細(xì)胞（未分選細(xì)胞）中60/61期細(xì)胞占69.34％，G2+S期細(xì)胞占30.66％，CD44-EPCAM-細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞占56.0

6、4％，G2+S細(xì)胞占43.96％，3群細(xì)胞之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CD44+EPCAM+細(xì)胞群處于低增殖狀態(tài)，傳統(tǒng)血清培養(yǎng)細(xì)胞（未分選細(xì)胞）群處于中等增殖狀態(tài)，CD44-EPCAM-細(xì)胞處于高增殖狀態(tài)；傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細(xì)胞、多重聯(lián)合分選后CD44+EPCAM+細(xì)胞、CD44-EPCAM-細(xì)胞接種72h后穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為（188±6）個(gè)/視野、（56±5）個(gè)/視野、（0±0）個(gè)/視野，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

7、0.05），CD44+EPCAM+細(xì)胞比傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細(xì)胞更具有侵襲能力，CD44-EPCAM-細(xì)胞無(wú)侵襲能力；分別測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)（4.、7、14、21、28d）各組小鼠成瘤情況，多重聯(lián)合分選后CD44+EPCAM+細(xì)胞接種NOD-SCID小鼠后成瘤時(shí)間早、瘤體增長(zhǎng)速度快，接種后第4、7、14、21、28d體積分別為（209.25±31.54）咖。、（500.00±72.90）mm3、（2280.00±440.91）inna、（4897

8、.00±1154.15）mm3、（11070.00±3559.86）mm3，而傳統(tǒng)血清培養(yǎng)細(xì)胞（未分選細(xì)胞）接種后成瘤時(shí)間相對(duì)較晚、瘤體增長(zhǎng)速度慢，CD44-EPCAM-細(xì)胞大量接種NOD-SCID小鼠后始終無(wú)瘤體形成，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CD44+EPCAM+細(xì)胞成瘤能力強(qiáng)于傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)細(xì)胞和CD44-EPCAM-細(xì)胞；移植瘤均在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)CD44和EPCAM，H&E染色可見(jiàn)細(xì)胞核大濃染，核漿比增大，核