膀胱腫瘤中相關(guān)基因的表達(dá)及其最佳反義位點的篩選.pdf

1、第一部分:UroplakinⅡ基因在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究 目的:探討UroplakinⅡ基因(UPⅡ)在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性膀胱移行細(xì)胞癌(TCC)中表達(dá)與意義。 方法:收集86例膀胱癌(其中TCC75例，非TCC11例)患者的癌組織，外周靜脈血標(biāo)本，提取總RNA，行RT-PCR，檢測UPⅡ基因mRNA的表達(dá)。25例其他部位腫瘤及5例非腫瘤患者組織標(biāo)本和靜脈血作為對照。 結(jié)果:86例膀胱腫瘤組織標(biāo)本中，UP

2、Ⅱ基因在TCC組織中平均陽性率76.0％(57/75)，11例非TCC類型膀胱癌0表達(dá)。在T1、T2、T3、T4期膀胱TCC患者組織中UPⅡ基因陽性率分別為81.48％、87.95％、65.21％、75％；在患者外周血中UPⅡ基因陽性率分別為14.8％、14.3％、56.5％、100％。在組織和在外周血中低分期分級(T1、T2)與高分期分級(T3，T4)TCC表達(dá)UPⅡ基因陽性率有顯著性差異(P＜0.05)。其中4例轉(zhuǎn)移者均陽性，接受全

3、身化療后3例未再表達(dá)。25例其他部位腫瘤組織標(biāo)本，7例肺癌在組織中有1例陽性表達(dá)，外周靜脈血中0表達(dá)；5例腎移行細(xì)胞癌在組織中2例陽性，外周靜脈血0表達(dá)；5例非腫瘤患者組織標(biāo)本及外周靜脈中0表達(dá)。 結(jié)論:組織及外周血中UPⅡ表達(dá)陽性率與腫瘤分期分級，是否轉(zhuǎn)移呈相關(guān)性；檢測TCC患者血中UPⅡ基因可作為監(jiān)測TCC患者是否轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，并可在一定程度上反映化療療效；其它類型膀胱癌未見UPⅡ表達(dá)；UPⅡ基因是膀胱移行細(xì)胞癌(TCC)較有

4、潛力的特異性靶標(biāo)基因。 第二部分:穩(wěn)定高表達(dá)UroplakinⅡ基因人膀胱癌細(xì)胞株的建立及其意義 目的:建立穩(wěn)定高表達(dá)UroplakinⅡ(UPⅡ)基因的人膀胱癌細(xì)胞株。 方法:采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含全長UPⅡ結(jié)構(gòu)基因的真核表達(dá)載體，進行酶切鑒定、核酸序列分析，并將其在陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染UPⅡ基因缺陷型膀胱移行細(xì)胞癌(TCC)細(xì)胞株EJ，經(jīng)G418篩選獲得抗性亞克隆細(xì)胞株；

5、RT-PCR、WesternBlotting方法對亞克隆細(xì)胞株進行UPⅡ基因表達(dá)鑒定。 結(jié)果:所獲UPⅡ基因真核表達(dá)載體pcDNA3-UPⅡ轉(zhuǎn)染EJ細(xì)胞后，通過G418持續(xù)壓力篩選4周獲得亞克隆細(xì)胞株EJ/UPⅡ；RT-PCR、WesternBlotting均未檢測到EJ細(xì)胞的UPⅡ基因表達(dá)，而EJ/UPⅡ細(xì)胞中UPⅡmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01)。 結(jié)論:通過基因轉(zhuǎn)染方法建立了穩(wěn)定高表達(dá)UPⅡ基因的膀胱

6、TCC細(xì)胞株，為進一步探討UPⅡ基因在膀胱TCC生物學(xué)行為中的作用及其靶向生物治療策略奠定了基礎(chǔ)。 第三部分:中國人膀胱移行上皮癌UroplakinⅡ基因的克隆及其真核表達(dá)載體構(gòu)建 目的:克隆中國人膀胱移行上皮癌(TCC)UroplakinⅡ基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體。 方法:采用分子克隆方法，從一例GⅢ/T3N0M0TCC組織標(biāo)本中提取總RNA，Primerpremier5.0軟件設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(R

7、T-PCR)法擴增UroplakinⅡ全長cDNA后進行核酸序列分析，并將其正向插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.0的限制性內(nèi)切酶位點XbaⅠ、HindⅢ之間；重組子經(jīng)酶切鑒定后，在陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000的介導(dǎo)下瞬時轉(zhuǎn)染UroplakinⅡ基因缺陷型膀胱癌EJ細(xì)胞株，RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞UroplakinⅡ的表達(dá)水平。 結(jié)果:核酸序列分析證實成功克隆出中國人UroplakinⅡ全長cDNA(555

8、bp)，經(jīng)BLAST檢索發(fā)現(xiàn)與國外報道的序列相比，同源性高達(dá)100％，并獲得GenBank序列登陸號(AY455312)。酶切鑒定表明UroplakinⅡ真核表達(dá)載體pcDNA-UPⅡ構(gòu)建成功。pcDNA-UPⅡ轉(zhuǎn)染EJ細(xì)胞72h后，癌細(xì)胞UroplakinⅡmRNA水平顯著增高(P＜0.01)。 結(jié)論:從中國人膀胱移行上皮癌組織中克隆出UroplakinⅡ基因，為深入研究UroplakinⅡ基因在TCC生物學(xué)行為中的作用及其靶

9、向生物治療策略奠定了基礎(chǔ)。 第四部分:膀胱移行細(xì)胞癌UroplakinⅡmRNA最佳反義結(jié)合位點的篩選 目的:篩選膀胱移行細(xì)胞癌(TCC)組織特異性表達(dá)基因UroplakinⅡ(UPⅡ)的mRNA最佳反義結(jié)合位點，為TCC的靶向生物治療奠定基礎(chǔ)。 方法:合成20mer隨機寡核苷酸文庫，與體外轉(zhuǎn)錄出的全長UPⅡcRNA雜交，RNaseH酶切割后，經(jīng)引物延伸、放射自顯影法篩選UPⅡmRNA的反義結(jié)合位點(ACS)，運

10、用RNADraw軟件分析、選定具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的ACS，合成互補性反義寡核苷酸(AS-ODN)；以單純RNADraw軟件設(shè)計的AS-ODN0作為實驗對照，將AS-ODN轉(zhuǎn)染高表達(dá)UPⅡ基因的TCC細(xì)胞株RT4，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測癌細(xì)胞UPⅡmRNA水平。 結(jié)果:體外共篩選出12個針對UPⅡmRNA的ACS，選定具有顯著莖環(huán)結(jié)構(gòu)的4個位點(分別位于UPⅡmRNA558bp～577bp、552bp～571bp、217

11、bp～236bp、97bp～116bp)合成AS-ODN1、AS-ODN2、AS-ODN3、AS-ODN4，轉(zhuǎn)染18h后分別使RT4細(xì)胞的UPⅡmRNA水平降低29.3％、82.7％、71.3％、70.9％，均顯著高于AS-ODN0對UPⅡmRNA表達(dá)的抑制率(14.3％)(P＜0.01)。 結(jié)論:采用隨機寡核苷酸文庫/RNaseH酶切割與計算機分析相結(jié)合的方法，能在體外有效篩選出UPⅡmRNA的反義核酸結(jié)合位點，對進一步研究U

12、PⅡ基因的生物學(xué)功能、膀胱TCC的靶向治療策略具有重要參考價值。 第五部分:Survivin最佳反義結(jié)合位點的篩選 目的:篩選腫瘤特意性基因Survivin最佳反義結(jié)合位點，為膀胱TCC的靶向生物治療奠定基礎(chǔ)。 方法:合成20mer:隨機寡核苷酸文庫，與體外轉(zhuǎn)錄出的全長SurvivincRNA雜交，RNaseH酶切割后，經(jīng)引物延伸、放射自顯影法篩選SurvivincDNA的反義結(jié)合位點(ACS)，運用RNADra

13、w軟件分析、選定具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的ACS，合成互補性反義寡核苷酸(AS-ODN)；以單純RNADraw軟件設(shè)計的AS-ODN0作為實驗對照，將AS-ODN轉(zhuǎn)染高表達(dá)Survivin基因的細(xì)胞株MKN-45細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測癌細(xì)胞UPⅡmRNA水平，MTT法測定細(xì)胞生長抑制率。 結(jié)果:體外共篩選出13個針對Survivin的ACS，選定具有顯著莖環(huán)結(jié)構(gòu)的4個位點(分別位于Survivin207bp～226bp

14、、187bp～206bp、126bp～145bp、44bp～63bp)合成AS-ODN1、AS-ODN2、AS-ODN3、AS-ODN4，轉(zhuǎn)染24h后分別使MKN-45細(xì)胞的Survivin水平降低54.3％±1.1％、32.2±1.3％、86.1±1.0％、56.2±0.9％，均顯著高于對照組AS-ODN0(18.3±1.2％，P＜0.01)。MTT法顯示細(xì)胞生長抑制率分別為28.12±1.54％，21.46±2.63％，38.42±