利用APE-PCR方法篩選白血病原病毒插入位點及相關(guān)基因的研究.pdf

1、白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病,它的發(fā)病機制至今尚未明確,影響其發(fā)病的因素有很多,病毒是影響因素之一。目前一般認(rèn)為,前病毒插入性誘變激活原癌基因可以產(chǎn)生白血病。于是尋找原病毒的插入位點,檢測白血病相關(guān)的遺傳學(xué)變異并發(fā)現(xiàn)相關(guān)的基因就具有重要的意義。另外,插入誘變對于在腫瘤生成中探索重要的生物學(xué)遺傳調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)途徑是一種有用的策略,而這一策略的成功實施主要依賴于一種有效的方法來鑒定基因組中的插入位點。
　　目的：旨在研究出一種新的

2、高效簡便地用于篩選白血病的原病毒插入位點和其他類型DNA元件插入位點的PCR方法;尋找在急性髓細(xì)胞白血病(AML)發(fā)生和產(chǎn)生耐藥過程中原病毒的共同插入位點,發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因。
　　方法：通過對原有PCR方法在酶切組合、連接效率、純化方法等方面進(jìn)行改進(jìn)得到一種用于克隆基因組DNA插入位點的PCR方法—末端腺苷引物延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(APE-PCR);同時構(gòu)建一種運用阿糖胞苷(Ara-C)治療的AML小鼠模型,利用APE-PCR方法對該模

3、型中收集到的原發(fā)性腫瘤樣本進(jìn)行原病毒插入位點鑒定;最后利用高通量測序法分析和尋找共同插入序列和相關(guān)基因。
　　結(jié)果：已經(jīng)證實APE-PCR方法可以擴增出更多更長的原病毒插入位點相關(guān)片段,產(chǎn)生較低的非特異性背景,需要更少的步驟和更少的DNA樣本量,還可以靈活地選擇限制性內(nèi)切酶,且花費更低的成本。在這個方法中利用納米級的磁珠替代常規(guī)磁珠可以提高其效率,而且使用少量的DNA也可以回收和分析原病毒插入位點(PIS)。另外,已經(jīng)初步篩選得到