鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1(RCAN1)抑制NF-κB活性的分子機(jī)制及其在淋巴瘤治療中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　本課題擬研究鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1對NF-κB作用的分子機(jī)制，及RCAN1對淋巴瘤生長的影響，并在此基礎(chǔ)上對RCAN1的臨床應(yīng)用進(jìn)行探討。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):共培養(yǎng)了HEK293、Raji、CA46、Daudi、Farage五種細(xì)胞，用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.RCAN1對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié):將RCAN1主要亞型RCAN1.1、RCAN1.4的表達(dá)質(zhì)粒pRCAN1.1-6myc、pRCAN

2、1.4-6myc和RCAN1的干擾質(zhì)粒si-RCAN1及其對照質(zhì)粒分別同pNF-κBLuc/pRLTK共同轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時后，收取細(xì)胞，通過雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)，檢測NF-κB啟動子的活性。
　　3.RCAN1影響核轉(zhuǎn)錄因子抑制子IκBα蛋白水平分子機(jī)制的研究:將RCAN1的表達(dá)質(zhì)粒pRCAN1.1-6myc、pRCAN1.4-6myc，干擾質(zhì)粒si-RCAN1及其對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，

3、轉(zhuǎn)染后48小時，提取細(xì)胞總蛋白，并通過Western Blotting技術(shù)、用anti-IκBα抗體檢測內(nèi)源性IκBα在細(xì)胞總蛋白中的表達(dá)水平。
　　4.RCAN1對淋巴瘤細(xì)胞系Raji、CA46、Daudi、Farage的細(xì)胞活性的檢測:包裝RCAN1的腺病毒表達(dá)載體Ad-RCAN1.1、Ad-RCAN1.4和對照病毒Ad-GFP。
　　5.檢測RCAN1在SCID鼠移植性淋巴瘤生長中的作用:用重組腺病毒Ad-GFP、Ad

4、-RCAN1.1感染淋巴瘤細(xì)胞系Raji，培養(yǎng)48小時后，用臺盼藍(lán)染細(xì)胞，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞活力，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　6.RCAN1與IκBα蛋白-蛋白相互作用及RCAN1功能區(qū)域的研究:將質(zhì)粒pRCAN1.1-6myc轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，48小時后收集細(xì)胞，用anti-myc(9E10)抗體做免疫沉淀，用anti-IκBα抗體做WesternBlotting檢測;相反的用anti-Iκ Bα抗體作免疫沉淀的抗體，用an

5、ti-myc(9E10)抗體做WesternBlot檢測，以確定RCAN1與內(nèi)源性IκBα的相互作用。
　　7.檢測RCAN1-1-103aa對NF-κB的作用及RCAN1對NF-κB的影響是否通過calcineurin起作用:將質(zhì)粒pRCAN1-1-103和質(zhì)粒pRCAN1.1-6myc分別同pNF-κ Bluc/pRLTK共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時后，通過雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測NF-κB的啟動子活性。

6、　　8.RCAN1及RCAN1-1-103蛋白質(zhì)的分離純化及蛋白活性的檢測:為進(jìn)一步研究RCAN1在抑制腫瘤方面的分子機(jī)制和臨床應(yīng)用，我們構(gòu)建了含有RCAN1.1基因的原核生物表達(dá)載體pet28b-RCAN1.
　　結(jié)果：
　　1.RCAN1抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　2.RCAN1通過提高胞質(zhì)內(nèi)IκBα的蛋白水平來降低NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　3.RCAN1通過抑制IκBα-Y42位磷酸化來提高IκBα的

7、蛋白質(zhì)水平。
　　4.RCAN1抑制淋巴瘤細(xì)胞系Raji的細(xì)胞活性:用腺病毒Ad-GFP、Ad-RCAN1.1、Ad-RCAN1.4以MOI為30感染淋巴瘤細(xì)胞系Raji，48小時后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的綠色熒光，感染效率達(dá)80％-100％，收取細(xì)胞，WesternBlot檢測RCAN1在Raji中表達(dá)良好，并發(fā)現(xiàn)Ad-RCAN1感染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)源性 IκBα的蛋白質(zhì)水平明顯增高，且Raji細(xì)胞的caspase3/7的水平也有所

8、升高。用腺病毒Ad-GFP、Ad-RCAN1.1感染Raji細(xì)胞，用CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RCAN1明顯抑制Raji細(xì)胞活性。而重組腺病毒對其他的淋巴瘤細(xì)胞系CA46、Daudi、Farage感染效率較低，且對細(xì)胞活力無明顯作用。
　　5.RCAN1抑制SCID鼠移植性淋巴瘤的生長:用重組腺病毒Ad-GFP、Ad-RCAN1.1感染淋巴瘤細(xì)胞系Raji，建立SCID鼠移植性淋巴瘤模型。對小鼠成瘤的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，RCAN1可以延遲

9、小鼠成瘤時間，早期降低小鼠成瘤率，且RCAN1.1高表達(dá)組小鼠的腫瘤體積要明顯的小于對照組，說明RCAN1可以抑制小鼠移植性淋巴瘤的生長。提取瘤組織總蛋白，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，RCAN1高表達(dá)組小鼠瘤組織中IκBα的蛋白質(zhì)水平明顯升高。
　　6.RCAN1與IκBα蛋白-蛋白相互作用及RCAN1功能區(qū)域的確定:CO-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)RCAN1與內(nèi)源性IκBα有相互作用，具體結(jié)果為用anti-myc做免疫沉

10、淀，用anti-IκBα可以檢測到與RCAN1相結(jié)合的IκBα;相反的用anti-IκBα抗體做免疫沉淀，然后用anti-myc(9E10)抗體做Western Blot檢測，也可檢測到與IκBα結(jié)合的RCAN1。IgG抗體做陰性對照。培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，收集細(xì)胞后，用DCT3抗體（RCAN1-N末端抗體）做免疫沉淀，用anti-IκBα抗體做Western檢測，進(jìn)一步確定了內(nèi)源性的RCAN1與內(nèi)源性IκBα之間存在蛋白-蛋白相互作用

11、。我們成功構(gòu)建了RCAN1.1的截短片段的表達(dá)質(zhì)粒，pRCAN1.1-103、pRCAN1-51-103、pRCAN1-51-172、pRCAN1-141-172、pRCAN1-141-197。將這些質(zhì)粒及pRCAN1.1-6myc分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48小時后，用anti-myc(9E10)做免疫沉淀，用anti-IκBα做WesternBlot檢測，發(fā)現(xiàn)RCAN1與內(nèi)源性IκBα相互作用的功能區(qū)域是N末端1-103aa，而其他

12、片段與內(nèi)源性的IκBα沒有相互作用。
　　7.RCAN1-1-103抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性且RCAN1對NF-κB的影響不依賴于calcineurin:將質(zhì)粒 pRCAN1-1-103和 pRCAN1.1-6myc分別同pNF-κBluc/pRLTK共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時后，通過雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)RCAN1-1-103可以抑制NF-κB的啟動子活性，其作用效果同RCAN1相似。用腺病毒Ad-RCAN1

13、-1-103感染的Raji細(xì)胞，細(xì)胞活性明顯受到抑制，即RCAN1-1-103可以抑制Raji的細(xì)胞活性。將質(zhì)粒pRCAN1-1-103、pRCAN1.1-6myc、si-RCAN1和calcineurin的表達(dá)質(zhì)粒分別同pNFATluc/pRLTK共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)與對照相比，RCAN1與calcineurin對NFAT的啟動子活性作用相反，說明RCAN1對NFAT的作用是通過抑制calcine

14、urin來抑制NFAT，而RCAN1-1-103對NFAT的啟動活性無作用。將質(zhì)粒pRCAN1.1-6myc、si-RCAN1和calcineurin的表達(dá)質(zhì)粒分別同pNF-κBluc/pRLTK共同轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，對NF-κB的啟動子活性的檢測發(fā)現(xiàn)RCAN1和calcineurin對NF-κB的作用趨勢一樣。以上結(jié)果證明了RCAN1引起的NF-κB啟動子活性的降低不依賴于RCAN1對calcineurin的抑制作用。

15、　　8.RCAN1.1及RCAN1-1-103蛋白質(zhì)的分離純化及蛋白活性的檢測:我們成功的構(gòu)建了含有RCAN1.1和RCAN1-1-103基因的原核生物表達(dá)載體，并將這些載體轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，保存了菌種。在蛋白質(zhì)的分離純化中，我們應(yīng)用Ni-NAT親和層析柱成功的獲得了高濃度的RCAN1-1-103蛋白和TAT-RCAN1-1-103蛋白。但是并未得到純化較好的RCAN1.1全長的蛋白質(zhì)。在純化蛋白的活性檢查中，我們用

16、純化的RCAN1-1-103和TAT-RCAN1-1-103蛋白處理HEK293細(xì)胞，通過細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，TAT-RCAN1-1-103蛋白可以成功的進(jìn)入細(xì)胞，而RCAN1-1-103則不能通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.RCAN1可以抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，降低NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核的水平，其胞質(zhì)的蛋白水平相應(yīng)的增加。
　　2.RCAN1可以通過提高IκBα的蛋白水平，對NF-κB起到抑制作用。

17、>　　3.RCAN1通過抑制Y42的磷酸化抑制IκBα的降解，提高IκBα的蛋白質(zhì)水平。
　　4.RCAN1通過提高IκBα的蛋白水平，抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，抑制淋巴瘤細(xì)胞系Raji的細(xì)胞活性。
　　5.RCAN1可以通過提高腫瘤細(xì)胞Raji內(nèi)IκBα的蛋白水平，抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，從而降低SCID小鼠移植性淋巴瘤的腫瘤發(fā)病率，并抑制移植性淋巴瘤的生長。
　　6.RCAN1與IκBα存在蛋白-蛋白相互作用，其