17β雌二醇對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、缺血性心臟病及其引起的心肌梗死和充血性心力衰竭是疾病死亡的首要原因。絕經(jīng)前女性缺血性心臟病的發(fā)病率明顯低于男性，絕經(jīng)后女性發(fā)病率迅速上升，甚至與男性相同，提示女性性激素，如雌激素對心血管具有有益的作用，流行病學(xué)證據(jù)、動物以及體外實驗也支持雌激素具有心血管保護(hù)作用?；A(chǔ)研究顯示雌激素在生物的發(fā)育、生長以及分化中具有重要作用，能夠通過調(diào)控多種信號通路影響細(xì)胞的增殖及凋亡，其中包括轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth fac

2、tor-β，TGF—β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。關(guān)于二者對腫瘤細(xì)胞的相互影響及調(diào)控機(jī)制研究較多，但對于二者對心肌細(xì)胞影響研究較少。氧化應(yīng)激是多種心臟疾病引起心肌肥厚、凋亡以及重構(gòu)共同的病理生理機(jī)制，目前已有研究發(fā)現(xiàn)雌激素具有一定的抗氧化作用。本研究以來源于大鼠胚胎心肌細(xì)胞的H9c2細(xì)胞為模型，觀察雌激素對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響，及其對TGF-β信號通路的作用，探討雌激素調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其生物學(xué)意義。
　　 目的

3、：觀察雌二醇(Estradiol，E2)對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響，及對TGF-β1信號通路的作用，探討雌激素調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制及其生物學(xué)意義。
　　 方法：以大鼠胚胎心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞作為細(xì)胞模型，1)采用MTT法以及流式細(xì)胞儀檢測法，以過氧化氫作(H2O2)為外源性氧化應(yīng)激刺激，觀察其對H9c2細(xì)胞活性和凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響，以及E2對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用；RT-PCR法檢測H9c2

4、細(xì)胞中雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)mRNA的表達(dá)情況；2)Realtime RT-PCR以及Western blot法檢測E2對H9c2細(xì)胞TGF-β1，轉(zhuǎn)化生長因子βI型受體(TβRI)以及轉(zhuǎn)化生長因子βII型受體(TβRII)mRNA以及蛋白表達(dá)的影響，Western blot檢測E2對TβR受體后磷酸化smad2/3水平的影響。
　　 結(jié)果：1)MTT分析顯示外源性H2O2呈濃度依賴性誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞活性

5、下降(P<0.05)，選擇100μM H2O2處理4小時作為后續(xù)試驗的誘導(dǎo)條件；單純應(yīng)用不同濃度E2(50-200nM)處理H9c2細(xì)胞對其活性均無明顯影響(P>0.05)；應(yīng)用200nM E2預(yù)處理H9c2細(xì)胞24小時可明顯減輕H2O2對H9c2細(xì)胞活性的損傷(P<0.05)，時相效應(yīng)分析顯示保護(hù)作用16小時達(dá)高峰可持續(xù)至24小時；應(yīng)用不同濃度E2(50-200nM)預(yù)處理24小時，E2呈濃度依賴性抑制H2O2對H9c2細(xì)胞活性的損傷

6、；依此結(jié)果選擇200nM E2預(yù)處理24小時作為后續(xù)實驗的干預(yù)條件。
　　 2)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡、ROS生成及E2的干預(yù)作用，結(jié)果顯示，外源性H2O2可引起H9c2細(xì)胞凋亡及ROS生成明顯增加，與對照組比較差異明顯(P<0.05)；E2預(yù)處理能夠明顯減輕H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，差異具有顯著性(P<0.05)。
　　 3)RT-PCR鑒定H9c2細(xì)胞ERα和ERβ的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)H9

7、c2細(xì)胞僅表達(dá)ERβ，幾乎不表達(dá)ERα，推測E2對H9c2細(xì)胞的抗凋亡保護(hù)作用可能是通過ERβ介導(dǎo)。
　　 4)Realtime RT-PCR以及Western blot檢測結(jié)果顯示應(yīng)用200nM E2處理H9c2細(xì)胞8小時后可下調(diào)TβRI以及TβRIImRNA的表達(dá)，處理16小時后下調(diào)TβRI以及TβRII蛋白表達(dá)，但是對于TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)均無明顯影響，給予ER阻斷劑ICI182，780阻斷E2與ER的結(jié)合，能夠

8、消除E2對TβRI及TβRII mRNA的下調(diào)作用。
　　 5)Western blot檢測p-smad2/3蛋白水平顯示，E2處理16小時后p-smad2/3蛋白水平降低。
　　 結(jié)論：
　　 1)外源性H2O2引起氧化應(yīng)激能夠引起細(xì)胞內(nèi)ROS增加，損傷H9c2細(xì)胞活性，增加H9c2細(xì)胞的凋亡。外源性E2本身并不能影響H9c2細(xì)胞凋亡，但能夠降低H9c2細(xì)胞對H2O2的敏感性，保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激引起的凋亡。<