漢坦病毒非編碼區(qū)調(diào)控功能的研究應(yīng)用及粘膜免疫初探.pdf

1、漢坦病毒是負(fù)鏈RNA病毒，基因組RNA分為三個(gè)節(jié)段：L、M和S。調(diào)控漢坦病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及包裝的信息被認(rèn)為存在于病毒的非編碼區(qū)（Noncoding regions，NCR）部分，由于5’和3’末端堿基有部分反向互補(bǔ)，所以通常由氫鍵形成“鍋柄狀”雙鏈結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)為環(huán)狀RNA，提供和病毒多聚酶相互作用的功能性啟動(dòng)子區(qū)。和同一家族的其它負(fù)鏈RNA病毒一樣，多聚酶催化轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板是核糖核蛋白（ribonucleoproteins，RNP），包

2、括全長(zhǎng)RNA片段、核蛋白和病毒多聚酶的復(fù)合體。 我們將報(bào)告基因綠色熒光蛋白（GFP）分別嵌入到漢坦病毒A9和L99株的L、M和S節(jié)段的5’和3’末端的非編碼區(qū)的互補(bǔ)序列之間，再分別將這3個(gè)嵌合的cDNA反向克隆到具有RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和終止子的載體pHH21中。將此3個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，A9（L99）病毒輔助感染，觀察GFP表達(dá)量的差別，以了解漢坦病毒啟動(dòng)子序列的特征以及3個(gè)節(jié)段的5’和3’末端非編碼區(qū)分別對(duì)于

3、蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)片段的NCRs均可以啟動(dòng)微復(fù)制子的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制；GFP在不同NCRs中的表達(dá)量不同：嵌入M片段的5’端和3’端非編碼區(qū)的GFP的表達(dá)量高于嵌入L片段的5’端和3’端非編碼區(qū)的GFP的表達(dá)量，而后者又高于嵌入S片段的5’端和3’端非編碼區(qū)的GFP的表達(dá)量。 報(bào)告基因的表達(dá)并非僅特異性的與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)，雖然這兩個(gè)過(guò)程都可以影響報(bào)告基因mRNA的量。為了更好的反映微復(fù)制子中非編碼區(qū)對(duì)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控能力

4、，除去翻譯過(guò)程對(duì)報(bào)告基因表達(dá)量的影響，比如mRNA的穩(wěn)定性等，我們同時(shí)應(yīng)用了定量PCR的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中GFP mRNA的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)節(jié)段報(bào)告基因的mRNA量有所不同，M>L>S，與GFP表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似。該研究結(jié)果表明，漢坦病毒3個(gè)片段非編碼區(qū)的啟動(dòng)子強(qiáng)度從M、L、S依次遞減。M片段非編碼區(qū)的調(diào)控能力最強(qiáng)，為我們接下來(lái)選擇M片段非編碼區(qū)連接GFP建立漢坦病毒指示細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。 漢坦病毒RNA在基因片段的3’和5’

5、術(shù)端都是高度保守的。每一個(gè)基因片段的3’端均為AUC AUC AUC UG，并與5’端反向互補(bǔ)?；虻?’和5’端形成穩(wěn)定的鍋柄狀（panhandle）結(jié)構(gòu)，可以在電子顯微鏡下觀測(cè)證實(shí)，這種鍋柄狀結(jié)構(gòu)也是布尼亞病毒科的一個(gè)重要標(biāo)志。漢坦病毒鍋柄狀結(jié)構(gòu)被認(rèn)為在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝方面起著非常重要的作用。已經(jīng)證實(shí)漢坦病毒屬的辛諾柏病毒、安第斯、普馬拉及首爾病毒的核蛋白可以形成三聚體結(jié)構(gòu)，并且可以特異性的識(shí)別它們病毒基因組的這種鍋柄狀結(jié)構(gòu)，

6、具有種屬內(nèi)的特異性和親和力。在病毒復(fù)制的起始階段，核蛋白三聚體和鍋柄狀結(jié)構(gòu)的相互作用可以幫助病毒的多聚酶識(shí)別和結(jié)合病毒RNA分子，而RdRp和核蛋白是病毒基因組復(fù)制所必需的，這些已經(jīng)在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。 漢坦病毒一般不引起可見(jiàn)的細(xì)胞病變，只有在低pH值的培養(yǎng)基中可能出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象，這使得傳統(tǒng)的細(xì)胞病變（Cytopathic effects，CPE）的方法不能被廣泛的使用。漢坦病毒在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，一般需7～14d病毒滴

7、度才達(dá)高峰，通常需采用免疫學(xué)方法進(jìn)行鑒定，存在耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大和靈敏度低等問(wèn)題。由于漢坦病毒存在較高的序列變異， RT-PCR需要相對(duì)高的技能和設(shè)備條件，而且不能檢測(cè)病毒感染的情況，基于RT-PCR的方法也因此未能得到大規(guī)模的推廣。 目前，基于激活泡沫樣病毒（FVs）的LXR（Long terminal repeats。LTR）的指示細(xì)胞系的方法已經(jīng)建立。病毒的滴度可以通過(guò)檢測(cè)LTR下游的報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)。報(bào)告基因主要包括β

8、半乳糖苷酶（β-gal），螢火蟲(chóng)熒光素酶（luc）和綠色熒光蛋白（GFP）基因等。來(lái)自于海洋生物維多利亞水母的GFP作為報(bào)告基因具有不需任何底物標(biāo)記、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性、可行活細(xì)胞觀察等優(yōu)點(diǎn)，既直觀易用，又可定量檢測(cè)，直接將基因表達(dá)的時(shí)間和空間聯(lián)系起來(lái)。在這些報(bào)告基因中，檢測(cè)GFP是最簡(jiǎn)單的，因?yàn)樗恍枰缸饔没蚬潭?xì)胞，這種指示細(xì)胞系已經(jīng)成功的應(yīng)用于牛及人泡沫樣病毒等的檢測(cè)。 目前預(yù)防漢坦病毒感染的疫苗主要是乳鼠腦純化

9、疫苗和地鼠/沙鼠腎細(xì)胞疫苗。但以腦組織及原代細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)來(lái)源復(fù)雜，不利于生產(chǎn)和質(zhì)量控制，并且需要采取注射途徑，不容易被接受。漢坦病毒主要通過(guò)其宿主動(dòng)物排泄物及分泌物經(jīng)消化道傳播或以氣溶膠形式經(jīng)呼吸道等途徑傳播，根據(jù)疫苗設(shè)計(jì)中的“原位免疫設(shè)計(jì)原則”，通過(guò)粘膜疫苗進(jìn)行免疫是合乎邏輯的。 粘膜疫苗可以減少疫苗的劑量，降低成本，應(yīng)用方便，是很有前途新型實(shí)用疫苗。粘膜免疫避免了注射引起的強(qiáng)烈應(yīng)繳，更易被接受；避免了由于注射免疫引起

10、血源性傳播疾??；安全易行，省時(shí)省力；可以同時(shí)誘導(dǎo)粘膜和全身免疫應(yīng)答，是一種全面而系統(tǒng)的免疫方法。對(duì)粘膜免疫的途徑的研究發(fā)現(xiàn)，滴鼻免疫可以直接將抗原呈遞到其攝取部位，更早和更強(qiáng)的誘發(fā)粘膜免疫反應(yīng)，比經(jīng)消化道免疫需要更少的抗原，效率更高。滴鼻免疫除可以誘發(fā)粘膜免疫反應(yīng)外，還可以誘發(fā)T、B細(xì)胞免疫，并且相對(duì)于口服疫苗來(lái)說(shuō)，更少導(dǎo)致免疫耐受?；诘伪敲庖呔哂猩鲜鰞?yōu)點(diǎn)，我們?cè)诒狙芯恐羞x擇滴鼻免疫途徑。 多數(shù)疫苗在通過(guò)粘膜途徑進(jìn)行接種時(shí)不能

11、誘使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，需要輔以免疫佐劑。大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT）來(lái)自于產(chǎn)毒大腸桿菌，具較強(qiáng)的黏膜佐劑效應(yīng)。LT和霍亂毒素（CT）的結(jié)構(gòu)有80％的同源性，均由一個(gè)A亞單位和一個(gè)五聚體B亞單位構(gòu)成。五個(gè)B亞單位聚合形成中空的面包圈樣結(jié)構(gòu)，中心與A亞單位非共價(jià)鍵結(jié)合。目前研究發(fā)現(xiàn)其B亞單位（B submit of Heat-labile enterotoxin，LTB）的功能是通過(guò)其上的神經(jīng)節(jié)苷脂（Ganglioside，GM1）結(jié)合受體

12、而使全毒素黏附于真核細(xì)胞上，是無(wú)毒的，但仍然具有很強(qiáng)的粘膜佐劑活性，是比較理想的粘膜佐劑之選。 LTB分子量為12．8kD左右，天然狀態(tài)下為五聚體形式存在，其在細(xì)胞質(zhì)中合成后在信號(hào)肽作用下分泌到周質(zhì)腔中形成五聚體并與相應(yīng)A亞單位組成完整的大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT），由于LTB分子量較小，所以在體外較難表達(dá)。本研究模擬LTB天然合成途徑，采用pET22b原核表達(dá)載體進(jìn)行分泌表達(dá)，為了便于下游純化和應(yīng)用，采用無(wú)毒的乳糖代替IPT

13、G誘導(dǎo)LTB表達(dá)。發(fā)現(xiàn)采用工作濃度為10g/L的乳糖額外誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，目的蛋白可占菌體總量的30％。之后采用Ni2+親和層析純化，最終在體外成功獲得純化的LTB，神經(jīng)節(jié)甘酯（GM1）結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明所獲得的LTB具有較好的生物活性。pET22b（+）原核表達(dá)載體是Novagen公司pET表達(dá)系統(tǒng)中的一員，目的基因通過(guò)基因克隆技術(shù)插入到pET表達(dá)載體中，并受T7轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控序列控制，T7啟動(dòng)子是目前原核表達(dá)中最強(qiáng)的啟動(dòng)子，表達(dá)效率非常高，本

14、研究所表達(dá)的rLTB可占菌體總蛋白的30％，1L菌液發(fā)酵最終可得9mg純化rLTB蛋白，足夠用于后續(xù)的佐劑生產(chǎn)。T7啟動(dòng)子的調(diào)控遵循乳糖操作子原理，可以采用乳糖作為誘導(dǎo)劑，乳糖價(jià)格低廉，并且無(wú)毒安全，所以在后期的疫苗試生產(chǎn)中具有重要意義。 選取6-8周齡C57BL/6雌性小鼠，隨機(jī)分成4組，每組6只，陽(yáng)性對(duì)照組為滅活病毒和鋁劑配伍的皮下注射；陰性對(duì)照組有單獨(dú)用滅活漢坦病毒滴鼻組和PBS滴鼻對(duì)照組。免疫時(shí)間次數(shù)為常規(guī)免疫，即免疫3

15、次。分別在0，14天，28天，其中在第3．5，7，14，35天尾靜脈取血分離血清；PBS沖洗陰道獲陰道沖洗液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以rLTB為佐劑的滅活漢坦病毒滴鼻免疫組產(chǎn)生了抗?jié)h坦病毒的體液免疫和粘膜免疫應(yīng)答，而單獨(dú)用滅活漢坦病毒滴鼻未能產(chǎn)生有效的抗?jié)h坦病毒核蛋白抗體水平。該結(jié)果提示以rLTB為佐劑經(jīng)鼻粘膜免疫途徑可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)漢坦病毒的特異性體液免疫和粘膜免疫應(yīng)答，研究漢坦病毒的粘膜免疫疫苗是可行的。 總之，本研究通過(guò)構(gòu)建以GF

16、P為報(bào)告基因的微復(fù)制子，對(duì)GFP在蛋白水平和mRNA水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)漢坦病毒非編碼區(qū)S、M和L片段均能調(diào)控GFP表達(dá)，三個(gè)片段非編碼區(qū)啟動(dòng)子調(diào)控能力有差別，為M>L>S。漢坦病毒的核蛋白可以形成三聚體結(jié)構(gòu)，并且可以特異性的識(shí)別它們病毒基因組的這種鍋柄狀結(jié)構(gòu)，具有種屬內(nèi)的特異性和親和力?；谝陨涎芯?，我們成功建立了以GFP為報(bào)告基因的漢坦病毒指示細(xì)胞系，該細(xì)胞系在無(wú)漢坦病毒感染時(shí)GFP不表達(dá)，可以特異性的識(shí)別漢坦病毒，并且可以隨時(shí)動(dòng)態(tài)觀