潮汕賁門癌患者父系遺傳背景及HLAⅠ類分子特征分析.pdf

1、背景：
　　南方沿海潮汕地區(qū)、福建閩南地區(qū)和北方內(nèi)陸河南太行山區(qū)，地理位置相距遙遠，生活環(huán)境迥異，卻同為我國的賁門癌高發(fā)區(qū)。據(jù)歷史記載，現(xiàn)今潮汕人群的祖先大多為中原內(nèi)陸居民（河南和山西）途經(jīng)福建閩南遷入潮汕。因此我們推測潮汕與河南賁門癌患者可能具有相似的遺傳背景。編碼人類白細胞抗原Ⅰ類分子（HLAⅠ類分子）復合體的基因具有高度的多態(tài)性，其等位基因分布、單倍型組成及頻率在不同人種和地區(qū)有明顯不同。惡性腫瘤的發(fā)生與HLAⅠ類分子基因多

2、態(tài)性及抗原表達異常有關。
　　目的：
　　1.利用父系遺傳標記Y-SNP和Y-STR從群體遺傳學水平證實潮汕與河南兩大賁門癌高發(fā)區(qū)賁門癌患者間存在較近的親緣關系。
　　2.發(fā)現(xiàn)潮汕賁門癌患者HLAⅠ類分子基因的體細胞突變及表達特征。
　　材料與方法：
　　1.材料
　　1）血樣：共316份。潮汕賁門癌患者（48份）,潮汕食管癌患者（73份）；潮汕客家人（32份）；潮汕鳳凰山畬族原住民（24份）；河南賁

3、門癌患者（64份）,河南食管癌患者（48份）；新疆哈薩克族食管癌、賁門癌高危人群（27份）。
　　2）組織標本：測序標本：45例潮汕賁門癌新鮮病理組織標本；
　　免疫組織化學標本：51例配對的賁門癌、癌旁組織及切緣組織的石蠟切片。
　　2.方法
　　1).基因分型：選取16個具有東亞人群特異性的Y-SNP及7個Y-STR位點進行研究。Y-SNP標記應用高通量SNP分型平臺MassARRAY時間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)

4、iPLEX Gold模塊（Sequenom Inc.）進行基因分型；部分標本應用ABI3730xl測序儀和PCR－RFLP方法進行驗證和補充；對于SNP位點M1，利用瓊脂糖凝膠電泳分型。對7個STR位點先進行熒光PCR擴增，再利用ABI3730xl測序儀毛細管電泳檢測分型。
　　2).SNP分析：根據(jù)每個個體的SNP分型結(jié)果及Y染色體國際命名委員會的命名原則，確定每個個體的單倍群，分析它們在四個研究人群中的頻率分布并進行卡方檢驗。

5、直接計算SNP基因型及單倍群多態(tài)性，并進行分層聚類、主成分分析及相關分析分析。
　　3).STR分析：根據(jù)每個個體7個Y-STR的分型結(jié)果，計算STR單倍型頻率。與比對資料一起進行分層聚類、主成分、及相關分析，利用Arlequin3.0軟件計算群體間的遺傳距離，然后再用Mega2.1軟件構(gòu)建N-J鄰接樹。繪制O3a3c1*單倍群的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖。
　　4).Sanger測序：對賁門癌組織標本進行HLA-A易感位點及其鄰近區(qū)域直接

6、測序。
　　5).免疫組織化學染色：檢測HLA-A、HLA-B、HLA-C在潮汕賁門癌癌變過程不同病變階段的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.SNP單倍群頻率分布差異：潮汕賁門癌患者的Y-SNP單倍群主要分布在O3*、O3a3c1*及O1a*，河南賁門癌患者頻率集中分布在O3*、O3a3c*及O3a1。O3*、O3a3c*及O3a3c1*是東亞北部人群的特征性單倍群，均具有M122-C突變，故可將這三個單倍群的頻率合并分

7、析。這三個單倍群在潮汕賁門癌患者、河南賁門癌患者、河南、福建及潮汕食管癌、賁門癌高危人群中的合計頻率分別為60.42％、63.49%、60.42%、66.21%和65.16％，差別無統(tǒng)計學意義，在鳳凰山畬族人群的合計頻率為37.5%，明顯低于賁門癌患者和高危人群。O1a*在潮汕客家人群的分布頻率為43.75%，明顯高于潮汕賁門癌患者，該單倍群在鳳凰山畬族人群中的分布頻率也較高。新疆哈薩克族高危人群的多態(tài)性集中在O*、F*/M*和K*單倍

8、群，而未檢出有其他單倍群多態(tài)性。
　　2.SNP多態(tài)性統(tǒng)計分析結(jié)果：Y-SNP分層聚類分析顯示潮汕賁門癌患者與潮汕、福建兩個高危人群緊密聚在一起，潮汕畬族與潮汕客家人群關系最近，河南賁門癌患者則與河南高危人群緊密聚在一起。主成分分析顯示潮汕賁門癌患者和賁門癌高危人群與河南賁門癌患者及其他高危人群距離較近而與潮汕客家和土著畬族人群的距離較遠。潮汕賁門癌患者與潮汕高危人群的相關系數(shù)最高,其次為福建高危人群，要高于與潮汕客家人群和潮汕原

9、住民畬族人群的相關系數(shù)。
　　3.STR多態(tài)性統(tǒng)計分析結(jié)果：Y-STR分層聚類分析、主成分分析顯示潮汕賁門癌患者與潮汕食管癌、河南食管癌患者、河南賁門癌患者、河南、福建與潮汕高危人群聚在一起。相關分析結(jié)果表明潮汕賁門癌患者與河南賁門癌患者間的相關系數(shù)最高。Y-STR遺傳距離分析顯示潮汕賁門癌患者與潮汕食管癌、河南食管癌和賁門癌患者間關系較近，這種親緣關系在分子系統(tǒng)樹中得到進一步的印證。對具有 O3a3c1*單倍群個體的Y-STR網(wǎng)

10、絡結(jié)構(gòu)圖示所有O3a3c1*賁門癌個體均來自同一個節(jié)點，緊密的聚在一起。
　　4.賁門癌HLA-A體細胞突變：與HLA-A基因標準序列比較，45例賁門癌組織中共檢測到16例突變，突變率為35.6%。其中5例樣本是3個位點的純合性突變，這三個位點是在歐洲血統(tǒng)人群（n=662）中測序發(fā)現(xiàn)位于外顯子區(qū)的SNP位點，而在1000 Genomics Brower數(shù)據(jù)庫顯示中國南北方漢族人群在這三個SNP位點均未發(fā)現(xiàn)突變。另外11例樣本的突變

11、位點是尚未報道過的位于非編碼區(qū)雜合性缺失T。
　　5.HLA-A、B、C抗原表達結(jié)果：HLA-A、B、C抗原陽性表達于細胞膜和細胞漿。賁門癌患者的賁門正常腺上皮、單純性增生上皮、上皮內(nèi)瘤變和浸潤癌均存在HLA-A、B、C抗原的低表達或缺失。HLA-A、B、C抗原強陽性表達的賁門癌組織分化較好，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低，其中高/中分化腺癌 HLA-C的強陽性表達率明顯高于低分化腺癌，差別有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：

12、>　　1.潮汕賁門癌患者和河南賁門癌患者、河南、福建、潮汕三地食管癌、賁門癌高危人群具有相近的父系遺傳背景。潮汕賁門癌患者和河南賁門癌患者可能來自一較近的共同祖先。
　　2.與高危人群對比，賁門癌、食管癌患者之間具有更相似的父系遺傳結(jié)構(gòu)，提示賁門癌、食管癌在高危人群中可能不是隨機發(fā)生,賁門癌和食管癌患者可能共享與發(fā)病相關的父系遺傳結(jié)構(gòu)。
　　3.賁門癌組織存在HLA-A基因突變，其具體功能仍需進一步探討。
　　4. H