阿德福韋酯規(guī)范治療停藥后復(fù)發(fā)慢性乙型肝炎患者的病毒準(zhǔn)種分析.pdf

1、目的:口服核苷（酸）類似物(nucleot(s)ide analogs，NAs)是目前持久抑制乙型肝炎病毒（HBV）復(fù)制的主要藥物，NAs治療后乙型肝炎復(fù)發(fā)的問題越來越引起廣泛重視。HBV在體內(nèi)以準(zhǔn)種的形式分布和存在，準(zhǔn)種多態(tài)性對停藥后復(fù)發(fā)患者再治療的療效及病情轉(zhuǎn)歸有重要影響。目前，對NAs治療停藥后復(fù)發(fā)再治療的研究主要集中于拉米夫定，對于阿德福韋酯等其他NAs的研究較少。國內(nèi)臨床研究僅提示使用阿德福韋酯規(guī)范化治療停藥復(fù)發(fā)的慢乙肝患者再

2、次使用阿德福韋酯仍然有效，而對于復(fù)發(fā)患者體內(nèi)乙肝病毒準(zhǔn)種構(gòu)成的研究則未見報(bào)道。本研究以單用阿德福韋酯規(guī)范化治療停藥復(fù)發(fā)的慢性乙型肝炎患者和未經(jīng)過抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者為研究對象，全面分析阿德福韋酯規(guī)范化治療停藥后復(fù)發(fā)患者體內(nèi)病毒準(zhǔn)種的準(zhǔn)確構(gòu)成;對比停藥復(fù)發(fā)患者與未抗病毒患者體內(nèi)病毒準(zhǔn)種構(gòu)成的差異，為阿德福韋酯規(guī)范化治療停藥后復(fù)發(fā)患者的再治療提供病毒學(xué)依據(jù)。
　　方法:收集阿德福韋酯規(guī)范化治療停藥后復(fù)發(fā)的慢乙肝患者及未抗病毒治

3、療的慢乙肝患者的血清，提取HBV-DNA;采用巢式PCR擴(kuò)增HBV多聚酶的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)(reverse transcription.RT)基因，一部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海Life technology公司直接測序，另一部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物繼續(xù)行瓊脂糖凝膠水平電泳，以分離目的DNA片段;膠回收純化目的DNA片段，將其連接到T載體上，轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的TOP10大腸桿菌中;X-gal-IPTG-AMP-LB瓊脂平板篩選陽性克隆，每個樣本挑取30個

4、陽性克隆，過夜培養(yǎng)后的菌液送至上海Life technology公司測定T載體上插入的目的DNA片段序列;測序結(jié)果由DNASTAR SeqMan拼接去除無關(guān)序列，以進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，包括去除載體序列、多序列比對、找出耐藥突變位點(diǎn)、計(jì)算準(zhǔn)種復(fù)雜度和準(zhǔn)種多樣性、進(jìn)化樹分析等;采用SPSS19.0對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:1.停藥復(fù)發(fā)組(n=25)與未抗病毒組患者(n=16)的乙肝病毒準(zhǔn)種中野生株的比例均大于93.33％，野生

5、株均為優(yōu)勢株。停藥復(fù)發(fā)組中含有耐藥突變的克隆與野生克隆之比為10/740，未抗病毒組中含有耐藥突變的序列與野生序列之比為8/472，卡方檢驗(yàn)得出P＞0.05，兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.停藥復(fù)發(fā)組與未抗病毒組的準(zhǔn)種復(fù)雜度Sn分別為0.974(0.044)和0.922(0.081)，P＞0.05，兩組間準(zhǔn)種復(fù)雜度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。停藥復(fù)發(fā)組與未抗病毒組的準(zhǔn)種多樣性(d、dS、dN)比較， P值分別為0.171、0.237、

6、0.197，均大于0.05，兩組間準(zhǔn)種多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.對慢性乙型肝炎患者的準(zhǔn)種復(fù)雜度及準(zhǔn)種多樣性(d、dS、dN)與血HBV-DNA水平進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示準(zhǔn)種復(fù)雜度及準(zhǔn)種多樣性與血HBV-DNA水平無相關(guān)性。4.所有樣本中檢測到的已知耐藥突變位點(diǎn)有:耐恩替卡韋的rtI169T、rtS202I、rtM250V,耐拉米夫定的rtV173L、rtL180M、rtM204I/V，耐替比夫定的rtM204I，耐阿

7、德福韋酯的rtA181V，未檢測到rtT184G、rtN236T突變。在未抗病毒組的患者的血清中也能檢測到如下已知的耐藥突變:rtI169V、rtA181V、rtS202I、rtL180M、rtM204I/V。僅在未抗病毒組患者的血清中檢測到1個含有阿德福韋酯耐藥突變(rtA181V)的克隆。5.巢式PCR擴(kuò)增的RT基因直接測序的結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)已知耐藥突變位點(diǎn)的存在，均為野生株序列;而巢式PCR擴(kuò)增RT基因TA克隆后測序的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)上述多

8、種已知耐藥突變的存在。6.停藥復(fù)發(fā)組患者與未抗病毒組患者在進(jìn)化樹中并無明顯聚集特征，序列間遺傳距離相近，均小于0.04。
　　結(jié)論:1.使用阿德福韋酯規(guī)范化治療后停藥復(fù)發(fā)的慢乙肝患者體內(nèi)準(zhǔn)種中的優(yōu)勢株仍為野生株，與未抗病毒治療的慢乙肝患者在準(zhǔn)種復(fù)雜度和多樣性上并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。停藥復(fù)發(fā)患者再次使用阿德福韋酯治療仍然有效。2.未行任何抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者體內(nèi)仍然存在耐藥突變株;TA克隆后測序與直接測序相比能更好的了解體內(nèi)病毒的