烏司他丁通過上調(diào)HO-1抑制IL-4介導的肥大細胞活化.pdf

1、目的:近期我們研究發(fā)現(xiàn)既往主要應用于治療感染中毒性休克、急性肺損傷等感染性炎性疾病的藥物烏司他丁在卵清蛋白(OVA)誘導的小鼠變應性炎癥模型中具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用，同時還發(fā)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用與血紅素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1密切相關。
　　烏司他丁(Ulinastatin，UTI)是一種高效廣譜的水解酶抑制劑，感染性炎癥以中性粒細胞介導為主，而變應性炎癥以嗜酸性粒細胞、肥大細胞等免疫細胞介導為主，二

2、者的作用機制截然不同。因此進一步深入明確UTI在變應性炎癥中的藥理作用機制，為其轉(zhuǎn)化為治療變應性炎癥的輔助用藥提供實驗室依據(jù)。HO-1屬于微粒體催化酶，是體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)和抗氧化的重要調(diào)控因子。前期實驗我們發(fā)現(xiàn)，烏司他丁在體內(nèi)實驗模型中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用與HO-1密切相關，烏司他丁是否是通過調(diào)控HO-1以及是通過何種信號通路來調(diào)控HO-1發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用的機制需要在體外細胞實驗模型中進一步探討。
　　肥大細胞是介導變應性

3、炎癥的免疫細胞之一，變應性炎癥的病理變化主要表現(xiàn)為肥大細胞活化脫顆粒，進而釋放大量炎性介質(zhì)。許多研究證明Th1/Th2細胞因子失衡是氣道變態(tài)反應性炎癥疾病發(fā)病機制的主要原因之一。因此實驗選取Th2的代表因子IL-4作為刺激因素，它可以刺激B細胞增殖，從而產(chǎn)生大量的IgE抗體，導致肥大細胞活化。因此，本課題選用IL-4刺激肥大細胞活化，建立體外細胞實驗模型對烏司他丁發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化的藥理作用機制進行深入探討。
　　方法:肥大細胞

4、（P815細胞株，購買自美國）培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基中，其中含有10％新生牛血清，根據(jù)實驗設計分組:空白對照組（Con組）、IL-4刺激組、烏司他丁干預組（UTI+IL-4組）、Znpp干預組(Znpp+UTI+IL-4組)。通過檢測類胰蛋白酶活力及Th1/Th2細胞因子（IL-5、IL-13、TNF-α、INF-γ）水平從免疫調(diào)節(jié)角度驗證烏司他丁是否能夠抑制IL-4介導的肥大細胞活化;通過檢測活性自由氧(ROS)、蛋白質(zhì)羥基含量水平、丙

5、二醛(MDA)及抗氧化酶指標:總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、微量還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的水平從氧化應激角度驗證烏司他丁是否能夠調(diào)節(jié)IL-4介導的肥大細胞活化引起的氧化/抗氧化失衡;應用血紅素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1的抑制劑Znpp驗證烏司他丁是否通過調(diào)節(jié)HO-1來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用;通過電泳遷移率(EMSA)、Western

6、Blot等方法檢測HO-1的上游調(diào)控因子Nrf2及相關信號通路探討烏司他丁調(diào)節(jié)HO-1表達的具體機制。
　　結果:
　　1.IL-4、UTI的最適干預時間和濃度通過MTT法及類胰蛋白酶活力實驗確定IL-4的最適宜濃度及干預時間分別為100ng/ml、6h;通過MTT法及UTI誘導HO-1蛋白水平的表達確定UTI的最適宜濃度及干預時間分別為100U/ml、2h。
　　2.Znpp抑制HO-1在肥大細胞中的表達肥大細胞在給

7、予HO-1的抑制劑Znpp干預后，HO-1的表達無論是在細胞免疫熒光水平，還是在蛋白表達水平都有明顯減弱趨勢，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.UTI抑制IL-4介導的肥大細胞脫顆粒IL-4刺激肥大細胞后，類胰蛋白酶活力明顯增強，高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); UTI能夠明顯降低類胰蛋白酶活力，抑制肥大細胞活化狀態(tài)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.UTI調(diào)節(jié)IL-4介導肥大細

8、胞活化引起的Th1/Th2細胞因子失衡Th1代表因子IL-5、IL-13、TNF-α的表達在IL-4刺激組明顯高于空白對照組，Th2代表因子INF-γ的表達明顯低于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); UTI明顯抑制IL-5、IL-13、TNF-α的表達，提高INF-γ的表達，從而調(diào)節(jié)IL-4介導肥大細胞活化引起的Th1/Th2細胞因子失衡，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.UTI調(diào)節(jié)IL-4介導肥大細胞活

9、化引起的氧化/抗氧化失衡在空白對照組中，活性自由氧(ROS)、蛋白質(zhì)羥基含量及丙二醛(MDA)處于低水平;給予IL-4刺激后，三個氧化應激損傷指標表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，抗氧化酶(T-AOC、SOD、CAT、GSH、 GSH-Px)水平明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);當給予UTI干預后，ROS、蛋白質(zhì)羥基含量及MDA水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，抗氧化酶(T-AOC、SOD、C

10、AT、GSH、GSH-Px)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.UTI誘導HO-1蛋白水平的表達，呈現(xiàn)時間及劑量依賴性在一定時間或濃度范圍內(nèi)，隨著UTI干預時間的延長或濃度的增加，HO-1蛋白水平表達呈現(xiàn)明顯增加趨勢，存在時間及劑量依賴關系，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　7.UTI誘導Nrf2核轉(zhuǎn)移隨著UTI干預時間的延長，Nrf2在胞漿中的表達逐漸降低，在胞核中的表達逐漸增強，存在Nrf

11、2從胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　8.UTI增強Nrf2與ARE的結合活性電泳遷移率檢測(EMSA)實驗結果顯示:隨著UTI干預時間的延長，Nrf2與ARE結合活性明顯增強。
　　9.UTI激活P38MAPK/Nrf2信號通路調(diào)節(jié)HO-1表達Western Blot結果顯示:隨著UTI干預時間的延長，UTI能夠增強磷酸化的P38蛋白表達水平，而磷酸化的JNK、ERK蛋白表達水平均無明顯差異性

12、;當實驗中分別加入P38的抑制劑(SB203580)，JNK的抑制劑(SP600125)以及ERK的抑制劑(PD98059)后，HO-1表達能被P38的抑制劑(SB203580)所抑制，而JNK及ERK的抑制劑對HO-1表達均無明顯作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.烏司他丁在IL-4介導的肥大細胞活化中具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用。
　　2.烏司他丁通過誘導HO-1表達發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧