烏司他丁通過(guò)上調(diào)HO-1抑制IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化.pdf

1、目的:近期我們研究發(fā)現(xiàn)既往主要應(yīng)用于治療感染中毒性休克、急性肺損傷等感染性炎性疾病的藥物烏司他丁在卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的小鼠變應(yīng)性炎癥模型中具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用與血紅素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1密切相關(guān)。
　　烏司他丁(Ulinastatin，UTI)是一種高效廣譜的水解酶抑制劑，感染性炎癥以中性粒細(xì)胞介導(dǎo)為主，而變應(yīng)性炎癥以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞介導(dǎo)為主，二

2、者的作用機(jī)制截然不同。因此進(jìn)一步深入明確UTI在變應(yīng)性炎癥中的藥理作用機(jī)制，為其轉(zhuǎn)化為治療變應(yīng)性炎癥的輔助用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。HO-1屬于微粒體催化酶，是體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)和抗氧化的重要調(diào)控因子。前期實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，烏司他丁在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用與HO-1密切相關(guān)，烏司他丁是否是通過(guò)調(diào)控HO-1以及是通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)調(diào)控HO-1發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用的機(jī)制需要在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)一步探討。
　　肥大細(xì)胞是介導(dǎo)變應(yīng)性

3、炎癥的免疫細(xì)胞之一，變應(yīng)性炎癥的病理變化主要表現(xiàn)為肥大細(xì)胞活化脫顆粒，進(jìn)而釋放大量炎性介質(zhì)。許多研究證明Th1/Th2細(xì)胞因子失衡是氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥疾病發(fā)病機(jī)制的主要原因之一。因此實(shí)驗(yàn)選取Th2的代表因子IL-4作為刺激因素，它可以刺激B細(xì)胞增殖，從而產(chǎn)生大量的IgE抗體，導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化。因此，本課題選用IL-4刺激肥大細(xì)胞活化，建立體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)烏司他丁發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化的藥理作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　方法:肥大細(xì)胞

4、（P815細(xì)胞株，購(gòu)買自美國(guó)）培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基中，其中含有10％新生牛血清，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組:空白對(duì)照組（Con組）、IL-4刺激組、烏司他丁干預(yù)組（UTI+IL-4組）、Znpp干預(yù)組(Znpp+UTI+IL-4組)。通過(guò)檢測(cè)類胰蛋白酶活力及Th1/Th2細(xì)胞因子（IL-5、IL-13、TNF-α、INF-γ）水平從免疫調(diào)節(jié)角度驗(yàn)證烏司他丁是否能夠抑制IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化;通過(guò)檢測(cè)活性自由氧(ROS)、蛋白質(zhì)羥基含量水平、丙

5、二醛(MDA)及抗氧化酶指標(biāo):總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、微量還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的水平從氧化應(yīng)激角度驗(yàn)證烏司他丁是否能夠調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化引起的氧化/抗氧化失衡;應(yīng)用血紅素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1的抑制劑Znpp驗(yàn)證烏司他丁是否通過(guò)調(diào)節(jié)HO-1來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用;通過(guò)電泳遷移率(EMSA)、Western

6、Blot等方法檢測(cè)HO-1的上游調(diào)控因子Nrf2及相關(guān)信號(hào)通路探討烏司他丁調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)的具體機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.IL-4、UTI的最適干預(yù)時(shí)間和濃度通過(guò)MTT法及類胰蛋白酶活力實(shí)驗(yàn)確定IL-4的最適宜濃度及干預(yù)時(shí)間分別為100ng/ml、6h;通過(guò)MTT法及UTI誘導(dǎo)HO-1蛋白水平的表達(dá)確定UTI的最適宜濃度及干預(yù)時(shí)間分別為100U/ml、2h。
　　2.Znpp抑制HO-1在肥大細(xì)胞中的表達(dá)肥大細(xì)胞在給

7、予HO-1的抑制劑Znpp干預(yù)后，HO-1的表達(dá)無(wú)論是在細(xì)胞免疫熒光水平，還是在蛋白表達(dá)水平都有明顯減弱趨勢(shì)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.UTI抑制IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒IL-4刺激肥大細(xì)胞后，類胰蛋白酶活力明顯增強(qiáng)，高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); UTI能夠明顯降低類胰蛋白酶活力，抑制肥大細(xì)胞活化狀態(tài)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.UTI調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)肥大細(xì)

8、胞活化引起的Th1/Th2細(xì)胞因子失衡Th1代表因子IL-5、IL-13、TNF-α的表達(dá)在IL-4刺激組明顯高于空白對(duì)照組，Th2代表因子INF-γ的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); UTI明顯抑制IL-5、IL-13、TNF-α的表達(dá)，提高INF-γ的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化引起的Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.UTI調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)肥大細(xì)胞活

9、化引起的氧化/抗氧化失衡在空白對(duì)照組中，活性自由氧(ROS)、蛋白質(zhì)羥基含量及丙二醛(MDA)處于低水平;給予IL-4刺激后，三個(gè)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抗氧化酶(T-AOC、SOD、CAT、GSH、 GSH-Px)水平明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);當(dāng)給予UTI干預(yù)后，ROS、蛋白質(zhì)羥基含量及MDA水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抗氧化酶(T-AOC、SOD、C

10、AT、GSH、GSH-Px)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.UTI誘導(dǎo)HO-1蛋白水平的表達(dá)，呈現(xiàn)時(shí)間及劑量依賴性在一定時(shí)間或濃度范圍內(nèi)，隨著UTI干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)或濃度的增加，HO-1蛋白水平表達(dá)呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，存在時(shí)間及劑量依賴關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7.UTI誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)移隨著UTI干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，Nrf2在胞漿中的表達(dá)逐漸降低，在胞核中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，存在Nrf

11、2從胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　8.UTI增強(qiáng)Nrf2與ARE的結(jié)合活性電泳遷移率檢測(cè)(EMSA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著UTI干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，Nrf2與ARE結(jié)合活性明顯增強(qiáng)。
　　9.UTI激活P38MAPK/Nrf2信號(hào)通路調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)Western Blot結(jié)果顯示:隨著UTI干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，UTI能夠增強(qiáng)磷酸化的P38蛋白表達(dá)水平，而磷酸化的JNK、ERK蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯差異性

12、;當(dāng)實(shí)驗(yàn)中分別加入P38的抑制劑(SB203580)，JNK的抑制劑(SP600125)以及ERK的抑制劑(PD98059)后，HO-1表達(dá)能被P38的抑制劑(SB203580)所抑制，而JNK及ERK的抑制劑對(duì)HO-1表達(dá)均無(wú)明顯作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.烏司他丁在IL-4介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化中具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用。
　　2.烏司他丁通過(guò)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧