ACK1和Src與腸道炎癥發(fā)生機(jī)制初探.pdf

1、背景與目的：
　　 腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）在維持健康方面起著重要的作用。除了經(jīng)典的吸收營養(yǎng)和水分及物理屏障功能外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)IEC既可以和管腔內(nèi)抗原又可以上皮內(nèi)及國有層的單核細(xì)胞相互作用，是復(fù)雜的粘膜免疫的一部分。IEC可以影響相鄰免疫和間質(zhì)細(xì)胞，招募循環(huán)炎性細(xì)胞回到粘膜。腸粘膜內(nèi)的炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞合成促炎因子，如白細(xì)胞介素(interleukin1，IL-1)、腫瘤壞死因

2、子(tumor necrosis factorα，TNF-α)和伽馬干擾素（interferon-γ，IFN-γ），反過來又會刺激相鄰的IEC。
　　 IECs發(fā)生功能性改變，受控制的、短暫的上皮通透性增加可以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是異常的、延長的屏障功能的丟失會介導(dǎo)過量的抗原和微生物進(jìn)入腸粘膜，從而引發(fā)病理性腸道炎癥，比如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的發(fā)生。IBD包括潰瘍性結(jié)腸炎(u

3、lcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn'sdisease，CD)，是慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥性疾病，病因未知。目前認(rèn)為與免疫、遺傳和腸道菌群有關(guān)。與其它慢性炎癥性疾病一樣，IBD也有癌變的風(fēng)險(xiǎn)。特別是腸道病變廣泛或者病程較長的UC病人，癌變的風(fēng)險(xiǎn)會增加20-30倍。慢性炎癥通過何種機(jī)制轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y目前尚不清楚。包括結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)在內(nèi)的腫瘤，都會有活性免疫細(xì)胞浸潤。這些細(xì)胞分泌細(xì)胞

4、因子，趨化因子、酶和生長因子，導(dǎo)致細(xì)胞周圍間質(zhì)的改變，形成有助于腫瘤生長、侵潤和最終轉(zhuǎn)移的環(huán)境。
　　 TNF-α是一種多效促炎因子，免疫細(xì)胞以及上皮細(xì)胞都可以合成TNF-α.TNF-α?xí)鹕掀すδ艿娘@著變化，如細(xì)胞通透性的改變、細(xì)胞周期進(jìn)程、營養(yǎng)吸收、基因表達(dá)。炎癥環(huán)境中的細(xì)胞毒效應(yīng)基本上都可以用TNF刺激細(xì)胞來模擬。人IBD、動物腸道炎癥模型中都可以看到TNF-α水平的升高。過表達(dá)TNF足夠誘導(dǎo)形成IBD老鼠模型?？筎NF

5、治療對難治性UC和CD有效。靶向抑制TNF-α為腸道炎癥的治療提供了新的方向。但TNF-α具體如何介導(dǎo)IEC的功能還不是很清楚。
　　 TNF-α最初被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)腫瘤出血性壞死。但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，TNF-α不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在一些情況下，TNF-α還能促進(jìn)細(xì)胞生存。TNF-α調(diào)節(jié)的抗凋亡信號通路包括AKT、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal-regulated kinases，ERK)/MA

6、PK和核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)，促凋亡信號通路包括p38和JNK。細(xì)胞的命運(yùn)取決于促凋亡和抗凋亡兩種信號通路的平衡。決定TNF調(diào)節(jié)這兩種不同功能的分子開關(guān)目前不是很清楚。IEC凋亡和增生的平衡是維持腸粘膜物理和結(jié)構(gòu)屏障的基礎(chǔ)。這一平衡的破壞會導(dǎo)致絨毛萎縮、上皮異型、正常吸收功能破壞以及癌變風(fēng)險(xiǎn)的增加。IBD的IEC凋亡增加。TNF-α在CRC的發(fā)展過程中起到很重要的作用。了解TNF-α調(diào)節(jié)IEC的功能，

7、包括抗凋亡作用，對理解TNF在炎癥和炎癥相關(guān)性瘤變中的作用意義非常重要。
　　 粘膜愈合是腸道損傷恢復(fù)的關(guān)鍵。通過可溶性GF和GFR調(diào)節(jié)IEC增生、遷移和凋亡對維持腸道粘膜屏障功能很關(guān)鍵。首先發(fā)現(xiàn)的TNF-α受體信號分子靶點(diǎn)就是EGFR。ErbB家族介導(dǎo)的信號是治療腸道炎癥性疾病的潛在途徑。EGF治療在實(shí)驗(yàn)性傷口愈合和UC臨床實(shí)驗(yàn)中都有效。但直到今天，TNF-α依賴的EGFR磷酸化的意義仍然不清楚。除了EGF和TNF-α，EGF

8、R可以被其它刺激，如GPCR以及細(xì)胞因子受體激動劑激活。TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞生存的信號通路與ErbB家族成員介導(dǎo)的促進(jìn)細(xì)胞生存相關(guān)的信號通路有部分是重疊的。但單個(gè)ErbB應(yīng)對上皮細(xì)胞損傷和炎癥的相關(guān)的信號通路不是很清楚。
　　 活化的Cdc42相關(guān)蛋白激酶(activated Cdc42-associated kinase1，ACK1)是一個(gè)位于細(xì)胞漿的保守的非受體酪氨酸激酶。ACK1的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)使得它可以和許多蛋白相互作用，參

9、與到很多生物過程中。ACK1在很多原發(fā)腫瘤，如肺癌、卵巢癌以及前列腺癌中，表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)細(xì)胞增生、分化，抑制凋亡，并與這些腫瘤的預(yù)后相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)（待發(fā)表數(shù)據(jù)），ACK1在腸道炎癥和腫瘤中的粘膜上皮細(xì)胞中表達(dá)和活性上調(diào)，但ACK1在腸道炎癥和腫瘤中的作用如何，目前不清楚。
　　 最近有研究發(fā)現(xiàn)，被受體酪氨酸激酶（或GPCR和整合素）活化的Src家族能促進(jìn)ACK1的活化。Src是一種與膜結(jié)合的非受體酪氨酸激酶，廣泛分布在

10、哺乳動物組織中。Src活化突變或者基因組擴(kuò)增少見，Src的活化常常伴隨上游激酶和磷酸酶導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)改變。在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，Src直接與RTK、GPCR、激素受體、以及涉及細(xì)胞粘附和遷移的轉(zhuǎn)錄因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和激活劑發(fā)生作用。Src成員對許多腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移起重要的作用。一些小分子Src抑制劑已經(jīng)處于臨床試驗(yàn)階段。腸道疾病中Src也常常高表達(dá)。重度UC中Src表達(dá)量高于輕度UC、急性UC以及正常粘膜。隨著腸癌進(jìn)展Src蛋白水平

11、和激酶活動性增加。Src的表達(dá)和活性與腸癌細(xì)胞株耐受接觸誘導(dǎo)凋亡成正相關(guān)。
　　 因?yàn)锳CK1和Src都與RTK特別是EGFR關(guān)系密切，而ACK1和Src在腸道炎癥和腫瘤中活性都增加，我們猜測ACK1和Src可能通過EGFR參與到腸道炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中。本文研究ACK1和Src在炎癥因子和生長因子刺激下參與的炎癥、生存、凋亡等信號通路，旨在探討ACK1和Src在腸道炎癥以及CAC中可能存在的作用以及作用機(jī)制，為IBD及相關(guān)癌

12、變的治療研究提供依據(jù)和方向。
　　 材料和方法：
　　 1.ACK1抗體和COX-2抗體購自Santa Cruz;MAPK抗體、pMAPK抗體、AKT抗體、pAKT抗體、pACK1、Src抗體、pSrc抗體、pErbB家族抗體、p65抗體購自Cell Signaling;人重組TNF-α、EGF、IL-1α和IFN-γ購自R&D。EGF或者TNF-α刺激細(xì)胞前，先用抑制劑處理30m: Src酪氨酸及酶抑制劑PP1、TAC

13、E抑制劑TAPI-1和EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478購自Calbiochem，MMP抑制劑BB94購自Tocris，ErbB2受體酪氨酸激酶抑制劑AG879、TGF-α中和血清購自R&D;IκBαTyr42抗體購自ECM Biosciences;ACK1抑制劑AIM-100、ACK1siRNA和Tyr176-AKT由SAB和Invitrogen公司代為合成。對照組加等體積液體:抑制劑用DMSO，EGF和TNF-α用pH7.4的PB

14、S。所有實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基。
　　 2.構(gòu)建caACK1和kdACK載體，構(gòu)建ErbB4過表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染caACK1和kdACK到IEC，檢測AKT的Tyr176位點(diǎn)以及AKT的Ser473磷酸化水平。轉(zhuǎn)染caACK1、ACK1siRNA，檢測IEC增生的改變。轉(zhuǎn)染ACK1siRNA和AIM-100處理IEC，檢測TNF-α誘導(dǎo)IEC凋亡的改變;檢測AIM-100對IL-1α和IFN-γ誘導(dǎo)IEC凋亡的影響;使用ACK1 siR

15、NA，檢測ACK1對TNF-α和EGF誘導(dǎo)IEC傷口愈合的影響。
　　 3.使用或者不使用AIM-100預(yù)處理，分別用EGF和TNF-α刺激無血清培養(yǎng)IEC，檢測ACK1的Tyr284、AKT的Tyr176磷酸化水平;使用或者不使用PP1預(yù)處理，EGF、TNF-α刺激無血清培養(yǎng)IEC，檢測ACK1的Tyr284;同時(shí)使用AIM-100和PP1預(yù)處理，EGF、TNF-α刺激無血清培養(yǎng)IEC，檢測AKT的Tyr176磷酸化水平;

16、r>　　 4.檢測Src、ACK1參與TNF-α和EGF刺激IEC的信號通路:EGF和TNF-α刺激IEC，分別抑制Src、ACK1、EGFR、ErbB2、ErbB4、TGF-α、MMP，檢測Src、ACK1、EGFR、ErbB2和ErbB4、PI3K、AKT、ERK、p38和p65亞基磷酸化水平;TNF-α刺激IEC，抑制Src、ACK1、EGFR、ErbB2和ErbB4，檢測IL-8、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2，C

17、OX-2)和cPLA2水平。
　　 5.分別抑制Src、ACK1，檢測Src、ACK1對EGF誘導(dǎo)NF-κB活化（IκBα的Tyr42磷酸化水平）的影響。
　　 6.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用Student's t檢測組間的差異。所有數(shù)值代表至少三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用mean±SEM表示。所有分析結(jié)果取雙側(cè)P值，P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.我們首先檢測ACK1表達(dá)水平

18、對IEC凋亡的影響。我們發(fā)現(xiàn)ACK1 siRNA轉(zhuǎn)染組的IEC凋亡率顯著高于對照組（t=-2.982，P=0.041）;轉(zhuǎn)染ACK1 siRNA同樣可以明顯促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的IEC凋亡（t=-13.877，P=0.000）。我們進(jìn)一步檢測ACK1活性水平對IEC凋亡的影響。我們發(fā)現(xiàn)ACK1抑制劑AIM-100處理組的IEC凋亡率顯著高于對照組（t=-2.915，P=0.043）;AIM-100預(yù)處理細(xì)胞也可以明顯促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的I

19、EC凋亡（t=-11.534，P=0.000）。腸道炎癥中的促炎因子除了TNF-α，還有IL-1α和IFN-γ等。但AIM-100預(yù)處理細(xì)胞對IL-1α（t=-1.281，P=0.269）或IFN-γ（t=-1.215，P=0.291）誘導(dǎo)的IEC凋亡率無影響。我們接著檢測ACK1表達(dá)水平對IEC增生的影響。ACK1 siRNA轉(zhuǎn)染組的IEC增生較對照組顯著降低（F=2520.833，P=0.000）。為檢測增生的抑制是否是因?yàn)榧?xì)胞周期

20、阻滯，我們還做了細(xì)胞周期分析。AIM-100處理IEC，然后用碘化吡啶染色，流式細(xì)胞技術(shù)檢測DNA含量。與對照組比較，AIM-100處理的IEC，G1期延長，S期縮短，AIM-100處理導(dǎo)致IEC在G1期發(fā)生阻滯(P=0.000)。以上結(jié)果顯示，ACK1表達(dá)和活化水平的提高可以促進(jìn)IEC生存。
　　 2.因?yàn)?4h內(nèi)傷口的愈合主要靠細(xì)胞遷移能力，所以早期傷口愈合實(shí)驗(yàn)也就能反映細(xì)胞的遷移能力。ACK1siRNA轉(zhuǎn)染組的傷口早期愈合

21、率顯著低于對照組（t=13.231，P=0.000）。EGF有促進(jìn)腸上皮愈合的能力，EGF處理組的傷口早期愈合率顯著高于對照組（t=-25.414，P=0.000）。轉(zhuǎn)染ACK1 siRNA可以顯著降低EGF刺激下的IEC傷口早期愈合率（t=43.528，P=0.000）。與EGF類似，轉(zhuǎn)染ACK1siRNA同樣也可以顯著降低促炎因子如100ng/mLTNF-α刺激下的IEC傷口早期愈合率（t=11.045，P=0.000）。
　

22、　 3.Src抑制劑PP1預(yù)處理IEC，EGF、TNF-α誘導(dǎo)的ACK1的Tyr284位點(diǎn)磷酸化都會受抑制，ACK1活性降低，提示在IEC中Src參與ACK1活化。與ACK1類似，抑制Src活性可以促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的IEC的凋亡。而且聯(lián)合使用Src抑制劑PP1和ACK1抑制劑AIM-100，TNF-α誘導(dǎo)的IEC凋亡率顯著高于單獨(dú)使用PP1(t=-10.638,P=0.000)或AIM-100(t=-11.851,P=0.000)。

23、
　　 4.ErbB家族成員屬于RTK。Src和ACK1都與RTK關(guān)系密切，參與傳遞RTK的信號。TNF-α刺激IEC，ErbB家族成員中EGFR、ErbB2和ErbB4磷酸化水平升高。抑制Src，TNF-α誘導(dǎo)的EGFR、ErbB2和ErbB4活性降低;抑制EGFR、ErbB2和ErbB4，Src活性稍有降低;提示在IEC中Src和ErbB相互作用。抑制ACK1，TNF-α誘導(dǎo)的EGFR、ErbB2和ErbB4活性不變。抑制E

24、GFR、ErbB2和ErbB4，ACK1活性明顯受抑制，提示在IEC中ErbB介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)ACK1活化。
　　 5.ErbB家族成員常常形成異源二聚體，如EGFR/ErbB2和EGFR/ErbB4等。IEC中，抑制EGFR、ErbB2和ErbB4，TNF-α誘導(dǎo)的Src、ACK1、AKT、ERK和PI3K活性受抑制。聯(lián)合抑制EGFR/ErbB2，TNF-α刺激IEC，Src、ACK1、AKT、ERK和PI3K活性受抑制程度

25、明顯強(qiáng)于單獨(dú)抑制EGFR或ErbB2。siEGFR轉(zhuǎn)染過表達(dá)ErbB4的IEC，TNF-α誘導(dǎo)的ACK1活性顯著降低。但我們發(fā)現(xiàn)抑制EGFR、ErbB2和ErbB4，對p65活化沒有影響。
　　 6.除了Src，MMP也參與TNF-α誘導(dǎo)的EGFR超激活。我們用MMP抑制劑BB94預(yù)處理再用TNF-α刺激IEC，發(fā)現(xiàn)MMP不僅會抑制TNF-α誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平，還能降低ACK1的磷酸化水平（圖11A）。因?yàn)門ACE是研究最

26、廣泛的一種MMP。所以我們用TACE抑制劑TAPI-1預(yù)處理再用TNF-α刺激IEC，發(fā)現(xiàn)TAPI-1可以下調(diào)EGFR、ACK1的磷酸化水平。但TAPI-1對EGFR、ACK1的抑制效果明顯弱于MMP。
　　 7.在胃、腸和肝細(xì)胞中，TGF-α常常與細(xì)胞膜結(jié)合。TNF-α誘導(dǎo)EGFR超激活都有MMP切割膜結(jié)合TGF-α促進(jìn)TGF-α的釋放。所以我們檢測TGF-α對Src和ACK1以及其它ErbB家族下游分子的關(guān)系。用TGF-α拮

27、抗劑預(yù)處理，與不用TGF-α拮抗劑預(yù)處理IEC相比，TNF-α誘導(dǎo)的EGFR、ErbB2和ErbB4活性，ACK1、AKT和ERK活性均降低。
　　 8.TNF-α和EGF刺激IEC，Src、ACK1、AKT、ERK、p38以及p65亞基磷酸化水平均增加。AKT、ERK、p38和NF-κB(p65)信號通路與腸道炎癥以及IEC的生存密切相關(guān)。我們檢測Src和ACK1對這些信號通路的影響。抑制Src，EGF誘導(dǎo)的ACK1、AKT、

28、ERK和p38活性降低明顯，p65亞基磷酸化水平略有下降;抑制ACK1，EGF誘導(dǎo)的AKT、ERK活性降低明顯，p65亞基磷酸化水平下降，Src和p38活性不變。抑制Src，TNF-α誘導(dǎo)的ACK1、PI3K、AKT活性降低，但ERK、p38以及p65亞基磷酸化水平無改變;抑制ACK1，TNF-α誘導(dǎo)的AKT活性也降低，但PI3K、ERK、p38以及p65亞基磷酸化水平無改變活性無影響。上述結(jié)果顯示IEC中， Src、ACK1介導(dǎo)EGF

29、誘導(dǎo)的炎性、凋亡信號通路與介導(dǎo)TNF誘導(dǎo)的不同。
　　 9.我們構(gòu)建caACK1和kdACK，并轉(zhuǎn)染caACK1和kdACK到IEC。我們發(fā)現(xiàn)caACK1可以磷酸化AKT的Tyr176位點(diǎn)。AKT的活性的標(biāo)志之一是AKT的Ser473磷酸化水平。caACK1可以上調(diào)AKT的Tyr176位點(diǎn)磷酸化水平，而且AKT活性升高;而kdACK1無法磷酸化AKT的Tyr176位點(diǎn)，AKT的Ser473磷酸化水平和AKT活性不變，提示ACK1

30、通過磷酸化AKT Tyr176殘基誘導(dǎo)AKT活化。
　　 10.我們進(jìn)一步研究EGF和TNF-α是否參與誘導(dǎo)的Tyr176位點(diǎn)的磷酸化以及ACK1是否介導(dǎo)EGF和TNF-α誘導(dǎo)的Tyr176位點(diǎn)的磷酸化。我們發(fā)現(xiàn)EGF和TNF-α刺激無血清培養(yǎng)IEC，ACK1的Tyr284和AKT的Tyr176磷酸化水平都會升高。AIM-100預(yù)處理IEC，EGF和TNF-α誘導(dǎo)的ACK1的Tyr284磷酸化水平降低，不僅抑制AKT的Tyr17

31、6磷酸化，而且AKT的Ser473磷酸化水平和AKT活性水平降低。上述結(jié)果提示在IEC中，ACK1介導(dǎo)EGF和TNF-α誘導(dǎo)的AKT的Tyr176磷酸化以及AKT活化。
　　 11.因?yàn)镋GF和TNF-α都會誘導(dǎo)p65磷酸化，但Src和ACK1對TNF-α誘導(dǎo)p65磷酸化無影響。之前有報(bào)道，EGF通過誘導(dǎo)IκBα的Tyr42磷酸化來激活p65，所以我們接著研究ACK1和Src是否通過介導(dǎo)IκBα的Tyr42磷酸化參與EGF誘導(dǎo)N

32、F-κB活化。抑制Src和ACK1，EGF誘導(dǎo)IκBα的Tyr42磷酸化水平都不會改變，但我們發(fā)現(xiàn)NF-κB活化相關(guān)的Bcl-2、c-IAP1和c-IAP2表達(dá)量下降，提示ACK1和Src不是通過磷酸化IκBα的Tyr42位點(diǎn)參與EGF誘導(dǎo)的NF-κB活化。
　　 12.IL-8、COX-2和cPLA2都在腸炎以及腸炎相關(guān)瘤變過程中起了非常重要的作用。TNF-α刺激IEC，IL-8、COX-2和cPLA2水平升高。我們繼續(xù)研究S

33、rc、ACK1以及ErbB家族成員的活性對這些炎性因子表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)，Src(CGP77675)、ACK1(AIM-100)和PI3K(LY294002)抑制劑可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的COX-2和cPLA2表達(dá)，提示Src、ACK1和PI3K都參與介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)COX-2和cPLA2表達(dá)。抑制EGFR、ErbB2、ErbB4，TNF誘導(dǎo)的COX-2和cPLA2表達(dá)水平也會降低。抑制ACK1（t=2.222，P=0.090）對T

34、NF誘導(dǎo)生成的IL-8無影響。而抑制EGFR(t=8.000，P=0.001)、ErbB2(t=6.325，P=0.003)、ErbB4（t=4.899，P=0.008）和Src（t=9.250，P=0.001），TNF誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)水平會降低。
　　 結(jié)論：
　　 綜上所述，TNF-α通過誘導(dǎo)ACK1和Src表達(dá)和活化促進(jìn)IEC生存。在炎癥環(huán)境下，特別是在TNF-α刺激下，ACK1發(fā)揮著重要的抗凋亡作用。活化的AC

35、K1還能提高IEC運(yùn)動能力。TNF-α刺激下，Src、MMP、ErbB和TGF-α都參與ACK1活化。Src和ACK1都介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的AKT的活化，并可能通過AKT，間接影響NF-κB活性。但Src和ACK1對TNF-α誘導(dǎo)的ERK和p65活化無影響。Src和ACK1參與介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的COX-2和cPLA2合成。另外，Src還促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的IL-8分泌。我們猜測ACK1和Src可能通過促進(jìn)細(xì)胞增生和運(yùn)動，抑制細(xì)胞凋亡參