負載RPL8蛋白的DC疫苗抑制乳腺癌生長的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 制備負載RPL8蛋白的DC疫苗，觀察DC疫苗對小鼠乳腺癌的療效，并探討其抑制乳腺癌生長的作用機制。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)Gene Bank提供的RPL8的mRNA序列設(shè)計引物，PCR擴增RPL8基因，與載體酶切、連接，構(gòu)建pET28a(+)-RPL8重組質(zhì)粒。
　　 2.構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，接種到含Kan的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)4h，加入IPTG

2、至終濃度1mmol/l，30℃，80rpm，震蕩搖6h，并取菌液進行SDS-PAGE和Western Blot。
　　 3.制備好的RPL8蛋白沖擊DC，熒光顯微鏡下觀察DC負載RPL8蛋白情況。
　　 4.負載RPL8蛋白的DC培養(yǎng)48h與尼龍毛柱子分離的小鼠脾臟T淋巴細胞按不同的比例混合，繼續(xù)培養(yǎng)72h，分別以不同效靶比加入到4T1細胞中培養(yǎng)48h，酶標儀測定其OD值。
　　 5.將負載RPL8蛋白的DC疫苗

3、注射入荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察乳腺癌腫瘤體積變化及小鼠的生存時間與瘤體的組織病理變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)酶切及測序鑒定，重組質(zhì)粒含有大約6124bp的片段，序列與gene bank一致，成功構(gòu)建了攜帶RPL8基因的重組質(zhì)粒。
　　 2.含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導(dǎo)后表達約28KD的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，獲得目的蛋白。
　　 3.RPL8蛋白與DC混合培養(yǎng)后，經(jīng)

4、熒光顯微鏡觀察，可見細胞內(nèi)有熒光顆粒。
　　 4.負載RPL8蛋白的DC疫苗體外殺傷4T1乳腺癌細胞的細胞毒活性與未負載RPL8蛋白的DC及PBS組比較，差異有顯著性(p＜0.05)。
　　 5.負載RPL8蛋白的DC疫苗，注入荷瘤小鼠體內(nèi)后，治療組的小鼠生存期和小鼠的腫瘤體積變化較對照組有顯著性差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 負載RPL8蛋白的DC疫苗對小鼠乳腺癌具有免疫治療作用，為乳腺癌的