人腫瘤內(nèi)皮標記物8(TEM8)SV3重組異型體的構(gòu)建及特點研究.pdf

1、本文以人與鼠的腫瘤內(nèi)皮標記物8(TEM8)SV3蛋白質(zhì)中存在96％氨基酸同源性為依據(jù)，應用前期鼠腫瘤內(nèi)皮標記物8(TEM8) SV3重組蛋白質(zhì)的有關(guān)數(shù)據(jù)，針對人腫瘤內(nèi)皮標記物8(TEM8) SV3重組蛋白的構(gòu)建，對其特點進行深入研究，進而為后續(xù)外源人體腫瘤內(nèi)皮標記物8(TEM8)抗原免疫小鼠做好前期準備。 在本研究中，我們以已知人乳腺癌細胞系腫瘤內(nèi)皮標記物8(TEM8) SV3 DNA為模板、設(shè)計引物并進行PCR擴增從而得到所需

2、的DNA。應用GATEWAY克隆技術(shù)，構(gòu)建克隆載體對其進行兩步克?。篖R反應--進入克隆與BP反應--表達克隆，得到我們所需要的重組DNA。在表達克隆過程中，我們應用了兩種不同的感受態(tài)細胞Ecoli.DH5α和BL21 StarTM(DE3)，對在不同的感受態(tài)細胞中的表達結(jié)果進行分析、優(yōu)化表達條件，然后將所得到的重組DNA結(jié)果進行測序、篩選，選擇同源性較高序列的DNA，進行蛋白質(zhì)的誘導表達。在蛋白質(zhì)的誘導表達過程中，我們同樣進行誘導時間

3、(3小時與5小時)、誘導試劑(NaCl與IPTG)及表達感受態(tài)細胞(E coli.DH5α和BL21StarTM(DE3))等誘導因素的篩選，然后將誘導效果較好的重組蛋白表達產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)的提取，最后我們將誘導產(chǎn)物進行了初步純化，并應用商用抗TEM8抗體做了Western雜交，得到以下結(jié)論： 1.我們首先得到了分子量為1000bp的人腫瘤內(nèi)皮細胞標記物8(TEM8) SV3 DNA。 2.在誘導實驗中，感受態(tài)細胞在克隆過

4、程與誘導表達過程中都起了極其重要的作用。在克隆過程中，由于感受態(tài)細胞E coli.DH5α不耐受T7 DNA聚合酶，同時維持其體內(nèi)的構(gòu)建條件，導致表達產(chǎn)物DNA的濃度低、RNA污染嚴重等。誘導表達也受到同樣的干擾，使得在誘導后的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物中得不到所需的表達蛋白。 3.從誘導表達的篩選中得到，對人腫瘤內(nèi)皮標記物8(TEM8)SV3蛋白質(zhì)的初步適宜的誘導條件為：以BL21 StarTM(DE3)為感受態(tài)細胞，IPTG為誘導試劑，