婦科復雜性疾病相關遺傳位點的確證及功能探索.pdf

1、第一部分TRIO通過誘導侵襲性偽足形成促進宮頸鱗癌的侵襲轉移
　　研究背景及目的：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，高危型 HPV（human papillomavirus,HPV）持續(xù)性感染是發(fā)病的首要病因。近年來隨著以高危型人乳頭瘤病毒為基礎的宮頸脫落細胞檢測的推廣，宮頸癌新發(fā)病例數(shù)較前已經大幅度減少，但是病死率仍然沒有得到改善，尤其在發(fā)展中國家，宮頸癌所致病患死亡已位列女性腫瘤相關性死亡的第二，甚至發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)了年輕化

2、的趨勢。因此，宮頸癌仍然是威脅病患生存的重要因素。腫瘤的侵襲轉移是病患死亡的重要原因，宮頸癌侵襲轉移具有一定獨特性：國際婦產科聯(lián)盟分期系統(tǒng)（International Federation of Gynecology and Obstertrics，F(xiàn)IGO）早期宮頸癌病患中已經可能有盆腔淋巴結的轉移。宮頸癌淋巴結轉移的狀態(tài)是病患預后的強烈影響因素。腫瘤細胞侵襲轉移能力的獲得依賴于腫瘤細胞基因組的相應改變。為了探索宮頸癌中基因組拷貝數(shù)變

3、異的特征，前期本研究組利用人類全基因組CGH芯片篩選出5p15高頻擴增片段。本研究驗證該高頻擴增片段，得到目標基因TRIO,并探索 TRIO基因在宮頸癌中的作用以及相關機制。
　　材料和方法：收集經病理診斷的宮頸癌組織作為病例組，以及因婦科良性疾病切除的正常宮頸組織作為對照組。提取組織的DNA、RNA，用real-time PCR的方法驗證5p15上基因拷貝數(shù)變化，以及mRNA表達情況。免疫組化探討TRIO在宮頸癌及正常宮頸中的表

4、達差異，并分析 TRIO表達對病患預后的影響。構建TRIO siRNA，轉染宮頸癌細胞系-SiHa細胞，劃痕，TRANSWELL檢測其對細胞侵襲轉移的作用，熒光標記鬼筆環(huán)肽骨架染色檢測細胞骨架變化，Western blot檢測下游通路靶蛋白的變化，利用薄熒光明膠包埋爬片檢測侵襲性偽足的形成，利用免疫熒光 cortactin熒光染色檢測侵襲性偽足成熟。
　　結果：在宮頸癌組織和正常宮頸組織DNA中，發(fā)現(xiàn)TRIO基因的拷貝數(shù)擴增頻率最

5、高。利用FISH檢測基因組拷貝數(shù)證實TRIO在宮頸癌組織的擴增。在表達水平上，mRNA和蛋白水平都顯示宮頸癌組織中的 TRIO表達高于正常宮頸（p<0.05）。分析TRIO表達與各個級別宮頸癌以及預后關系結果顯示，TRIO高表達與宮頸癌的進展以及宮頸癌淋巴結轉移相關。在多因素生存分析中顯示TRIO可能作為一個獨立的預后因子。構建并合成TRIO-siRNA，在SiHa細胞中的驗證發(fā)現(xiàn)下調TRIO的表達后，細胞侵襲遷移能力下降。細胞骨架的染

6、色顯示沉默TRIO以后SiHa細胞骨架變得松散。下調了TRIO以后侵襲性偽足形成減少，成熟也減少。探索 TRIO影響侵襲性偽足形成的下游因素，發(fā)現(xiàn)分別下調TRIO下游Rac1和RhoA,侵襲性偽足的形成以及成熟均受到影響。Western blot檢測下游通路蛋白發(fā)現(xiàn) TRIO分別通過 TRIO/Rac1/PAK1和TRIO/RhoA/Rock/MT1-MMP兩條通路影響侵襲性偽足的形成以及成熟。
　　結論：TRIO過表達通過TRI

7、O/Rac1/PAK1和TRIO/RhoA/Rock/MT1-MMP通路誘導侵襲性偽足的形成誘導宮頸癌的侵襲轉移。
　　第二部分FOXP3，WNT4基因多態(tài)性與子宮內膜異位癥相關性研究
　　研究背景及目的：子宮內膜異位癥（內異癥，EMs）是內膜組織在子宮腔以外種植。流行病學調查，約有5％-10%的育齡期婦產受其影響，更有高達50%的不孕癥的婦女罹患內異癥。子宮內膜異位癥常常導致痛經，慢性盆腔疼，性交痛以及繼發(fā)性不孕。現(xiàn)有研究

8、表明有內異癥家族的婦女罹患內異癥的風險比無家族史的增加了近5倍。盡管內異癥的病理過程仍不清楚，但是認為內異癥是一種有環(huán)境，遺傳以及環(huán)境和遺傳相互作用的多因素疾病。近年來，內異癥 GWAS研究發(fā)現(xiàn)了一批與內異癥發(fā)生發(fā)展相關的遺傳標記，其中包括免疫相關基因 FOXP3，女性生殖道發(fā)育相關基因WNT4等。之后多項研究在不同人群中驗證這些點。但是卻沒有得到一致的結果。因此，本研究采用候選法，在中國人群中對FOXP3和WNT4基因多態(tài)性與內異癥的

9、關聯(lián)進行探索。
　　材料和方法：抽取符合要求的病患外周血，存于 EDTA-Na的采血管中。利用Quickgene DNA全血試劑盒提取白細胞的基因組DNA。應用MassARRAY-IPLEX技術和機制輔助激光解吸電離飛行時間質譜平臺對314例子宮內膜異位癥患者和358例正常對照進行FOXP3基因分型。利用Taqman探針基因分型技術對646例子宮內膜異位癥患者和766例正常對照進行WNT4基因分型。
　　結果：對FOXP3基

10、因，內異癥組和對照組 rs2280883位點存在 C/T多態(tài)性,rs3761548存在A/C多態(tài)性rs3761549存在C/T多態(tài)性。與對照組相比，內異癥組rs2280883,rs3761549的三種基因型CC,CT,TT分布（P=0.770，OR=0.960；P=0.923,OR=1.013）和等位基因 C,T頻率（P=0.772，OR=0.960；P=0.925，OR=1.013）差異均無統(tǒng)計學意義；同時，位點rs3761548的3

11、種基因型AA,AC,CC分布（P=0.762，OR=0.958）和等位基因 A,C頻率（P=0.715，OR=0.950）在內異癥組和對照組間的差異亦無統(tǒng)計學意義。按照r-AFS分期，將內異癥組分成I-II期和III-IV期。在內異癥I-II期和內異癥III-IV期患者中，rs2280883，rs3761549基因型 CC,CT,TT分布（P=0.454，OR=1.198,P=0.526，0R=0.909；P=0.220，OR=0.75

12、0，P=0.548，OR=1.094）和等位基因 C,T分布（P=0.473，OR=1.215，P=0.532，OR=0.912；P=0.204，OR=0.737，P=0.558，OR=1.089），分別與對照組比差異無統(tǒng)計學意義。同樣，rs3761548位點3種基因型AA,AC,CC（P=0.431，OR=1.211；P=0.508，0R=0.905）和等位基因A,C（P=0.417，OR=1.226；P=0.516，OR=0.908

13、）分別在內異癥兩種分期患者中的分布與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。對WNT4基因，探索了rs7521902（A/C），rs16826658（G/T），rs7515106（C/T） and rs2235529（A/G）。rs2235529與內異癥的發(fā)病相關(p=1.80E-03，odds ratio[OR],95% confidence interval[CI]=1.311,1.129-1.522)，尤其是分級為Ⅲ/Ⅳ的病患。其余的三個點均