聯(lián)合基因（CD和TNF-α）治療喉癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、喉癌是最常見(jiàn)的頭頸惡性腫瘤之一，全球每年約有190，000例新增喉癌病例，并且其發(fā)病率有增高趨勢(shì)。晚期喉癌經(jīng)手術(shù)或術(shù)后輔以放療或化療的5年生存率不足60％，術(shù)后造成喉功能全部或部分喪失，生活質(zhì)量明顯下降，嚴(yán)重的威脅著人類(lèi)的生命和健康。 基因治療是治療惡性腫瘤的最具有潛力的新方法，由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是多因素及多階段的復(fù)雜過(guò)程，聯(lián)合基因治療可從多個(gè)環(huán)節(jié)控制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，提高基因治療的腫瘤抑制率和抗腫瘤免疫效應(yīng)，降低其毒副

2、作用。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行的有關(guān)聯(lián)合基因抑制腫瘤的實(shí)驗(yàn)，均存在聯(lián)合基因構(gòu)建操作復(fù)雜，容易突變，腫瘤抑制效果不理想，選擇的基因治療窗小等不足，同時(shí)未見(jiàn)有胞嘧啶脫氨酶(eytosinedeaminase，CD)基因聯(lián)合腫瘤壞死因子-α(toumornecrosisfactor-α，TNF—α)基因治療喉癌的實(shí)驗(yàn)研究。 自殺基因前體藥物系統(tǒng)CD/5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)將無(wú)毒性前藥5-Fc轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒產(chǎn)

3、物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，從而阻止DNA合成，使靶細(xì)胞走向死亡。TNF—α能充分調(diào)動(dòng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，對(duì)腫瘤有直接殺傷作用，損傷腫瘤組織微血管。兩種基因的腫瘤抑制機(jī)制不同，而且有協(xié)同作用，因而可以從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制腫瘤生長(zhǎng)，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高腫瘤抑制率及抗腫瘤免疫反應(yīng)的目的。 質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)跟常用的病毒載體比較，具有無(wú)免疫原性、安全、能穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。另外pcDNA3.1(+)中C

4、MV啟動(dòng)子來(lái)源于巨細(xì)胞病毒，是可以啟動(dòng)外源性基因表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子；并且本研究所插入的目的基因CD和TNF-α片段小，僅有1284bp和687bp，操作簡(jiǎn)單。 本研究通過(guò)構(gòu)建自殺基因CD聯(lián)合細(xì)胞因子TNF—α基因共表達(dá)的非病毒載體并導(dǎo)入喉癌Hep-2細(xì)胞，觀察CD基因和TNF—α基因共表達(dá)產(chǎn)物在5-FC作用下于體內(nèi)外對(duì)喉癌細(xì)胞系Hep-2的殺傷作用并研究其作用機(jī)制。 研究方法： 1.構(gòu)建目的基因真核表達(dá)載體pcDNA

5、3.1(+)/TNF-α-IRES—CD、pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF—α，并用酶切、PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。 2.將以上各目的基因真核表達(dá)載體及pcDNA3.0(+)空白質(zhì)粒在Lipofectamine2000介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞Hep-2，G418篩選出抗性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)株，分別命名為Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF-α、Hep-2/0，RT—PCR

6、檢測(cè)各目的基因的表達(dá)。 3.MTT法檢測(cè)體外細(xì)胞殺傷作用。 4.MTT法檢測(cè)旁觀者效應(yīng)。 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 6.用BALB/c裸鼠構(gòu)建Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四組人喉鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型。細(xì)胞接種的第8天(移植瘤直徑約5mm)開(kāi)始，每天腹腔給予5-FC，連續(xù)12天。比較給藥前后腫瘤體積變化、腫瘤倍增時(shí)間及抑瘤率，通過(guò)病理切片觀察組織病理變

7、化。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示，用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.目的基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染1.1目的基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF—α、pcDNA3.1(+)-TNF—α—IRES—CD構(gòu)建成功，經(jīng)酶切、PCR和DNA測(cè)序證實(shí)各插入基因及聯(lián)合基因的大小、位置、方向均正確

8、無(wú)誤。 1.2RT—PCR證明各重組外源基因在已轉(zhuǎn)染目的基因真核表達(dá)載體的喉癌細(xì)胞系Hep-2中均有表達(dá)。 2.體外實(shí)驗(yàn) 2.1體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)Hep-2/TIC組的細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)，其殺傷作用呈濃度依賴(lài)性，與Hep-2/CD、Hep-2/TNF-α、Hep-2/0組的差異均有顯著性(P<0.05)。 2.2體外旁觀者效應(yīng)Hep-2/TIC，Hep-2/CD組細(xì)胞均顯示出明顯的旁觀者效應(yīng)，其中以Hep-2

9、/TIC組最明顯，兩組間的差異有顯著性(P<0.05)。而Hep-2/TNF—a和Hep-2/0組細(xì)胞未顯示出旁觀者效應(yīng)。 2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四組細(xì)胞中以Hep-2/TIC組的凋亡率最高，四組兩兩之間比較差異均有顯著性(P<0.05)。 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 3.1人喉鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建經(jīng)典的皮下種植方法成功構(gòu)建人喉鱗癌裸鼠皮下移植瘤模

10、型，細(xì)胞注射數(shù)量為5×106，成瘤率83％，成瘤時(shí)間6—8天。 3.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抑瘤作用Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/TNF—α、Hep-2/0四組裸鼠中，Hep-2/TIC組裸鼠移植瘤的倍增時(shí)間最長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度最慢、治療后移植瘤平均體積最小，抑瘤率達(dá)97.40％，其中有一只裸鼠移植瘤完全消除。 3.3移植瘤的組織病理學(xué)3.3.1HeF-2/TIC組：移植瘤內(nèi)見(jiàn)大量腫瘤組織壞死，有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)

11、胞分裂相少見(jiàn)。 3.3.2Hep-2/CD組：移植瘤內(nèi)見(jiàn)較多壞死組織及有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 3.3.3HeF-2/TNF一α組：移植瘤內(nèi)見(jiàn)大量壞死組織及有極少淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 3.3.4Hep-2/0組：移植瘤內(nèi)見(jiàn)低分化鱗狀細(xì)胞腫瘤組織，許多有絲分裂相的腫瘤細(xì)胞和瘤巨細(xì)胞，而腫瘤壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了目的基因真核表載體pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/