辛伐他汀和非諾貝特對NAFLD大鼠ATGL酶和TNF-α表達調控的實驗研究.pdf

1、研究背景:隨著近年來人們飲食結構的改變和不良生活方式增加，(NAFLD)的發(fā)病率正逐步上升，是目前最常見的慢性肝病之一。目前我國普通人群的患病率為10％-16％，全球平均患病率約為10.24％，在肥胖人群中增加到57.5-74％，對于排除了其他肝病原因的無癥狀性轉氨酶升高，約42-90％是由于NAFLD所引起。NAFLD是一類病理改變類似于酒精性肝病(ALD)但無過量飲酒史的以肝細胞大泡性脂肪變性和脂質蓄積為特征的病理綜合癥，包括單純性

2、脂肪肝(simple steatosis)、脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化(hepatic fibrosis)和肝硬化(hepatic cirrhosis)幾個連續(xù)的病理過程，部分患者甚至會進展至肝癌及肝功能衰竭等終末期肝病?，F認為NAFLD是代謝綜合征(MS)在肝臟的表現，它與肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、高胰島素血癥、高血壓病等密切相關，嚴重危害人類健康。
　　 NAFLD的發(fā)病率正在迅猛升高，已成為危害人類健康最常見的慢性

3、肝臟疾病之一。然而其明確的發(fā)病機制尚不清楚，還停留在假說階段。目前較公認的是1998年Day提出的“二次打擊”學說。該學說認為初次打擊主要指胰島素抵抗(IR)和脂質代謝紊亂所導致的肝細胞脂質沉積，導致肝臟脂肪變性，既為進一步的脂質過氧化(LP)反應提供了反應基質，也使肝臟對各種損傷打擊的易感性增高;二次打擊主要指各種原因在此基礎上所致的氧化應激(OS)與脂質過氧化(LP)損傷。1993年腫瘤壞死因子(TNF-α)被認為是一種由脂肪細胞分

4、泌的脂肪因子，亦是脂肪細胞中最先鑒定出來的炎癥因子。它在局部脂肪組織中的表達與肥胖程度有一定正相關，是介導肝細胞損傷的脂源性因子中最重要的一種，可參與肝臟炎癥及纖維化進展。而近年來研究發(fā)現，脂肪因子TNF-α在誘導和加重IR有重要作用。
　　 研究發(fā)現，TNF-α除可作用于胰島素信號轉導系統(tǒng)，使胰島素受體底物磷酸化受阻，直接引起IR參與“初次打擊”外，還可誘導IL-1、IL-6等細胞因子的產生，共同參與肝損害和肝臟炎癥反應，并通

5、過脂質過氧化(LP)使細胞受損，為“二次打擊”提供了反應基質。從而促使單純性脂肪肝向脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化演變。
　　 NAFLD的典型特征是肝臟脂肪積聚。而甘油三酯(TG)是NAFLD患者肝臟內蓄積的主要脂質。肝臟攝取的脂肪酸絕大多數由貯存于脂肪細胞的脂肪分解而來，但NAFLD患者的肝臟TG來源與正常人比較只有60％來自游離脂肪酸(FFAs)，而25％來自肝臟自身合成的脂肪酸(DNL)，15％來自飲食攝入。這提示NAFLD患

6、者肝臟自身合成脂肪酸是增加的，且有數條通路參與肝臟脂質蓄積，其中外周來源的脂肪酸增多和DNL是NAFLD肝內脂肪蓄積的主要因素。TG在肝臟組織中的過多儲積是NAFLD發(fā)生的先決條件。而肝臟TG的積聚是合成與轉化失衡的結果，這提示在肝臟脂質積聚的過程中可能還存在著TG的分解代謝受限。
　　 長期以來，激素敏感脂肪酶(HSL)被認為是脂肪分解主要限速酶，但隨著HSL基因敲除小鼠的出現，人們開始猜測在脂肪細胞中還存在著其它甘油三酯水解

7、酶。2004年Zimmermann等篩選人和鼠類基因和蛋白質數據庫，尋找和已知脂肪酶具有同源性的蛋白，結果發(fā)現了脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL)，不久Jenkins等和Villena等亦同樣發(fā)現了這種蛋白。Zimmermann等利用受轉染的COS-7細胞證明了ATGL催化甘油三酯水解為甘油二酯，但不水解膽固醇或者視黃醇。ATGL是一種催化甘油三酯第一步水解的重要脂肪酶，而HSL則主要水解甘油二酯，因此ATGL和HSL是脂肪分解反應的共同

8、限速酶。而至目前為止，了解到多種因素可調節(jié)ATGL。比較基因組學鑒定蛋白58(CGI-58)特異性活化ATGL，在脂肪細胞中可與ATGL共同作用把甘油三酯水解酶活性提高20倍，從而刺激脂肪的分解，這證明CGI-58對ATGL酶活性發(fā)揮著重要作用;過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)屬于PPAR家族，還包括和PPAR-α，PPAR-β。PPAR-γ可調節(jié)脂肪代謝的很多方面，包括游離脂肪酸氧化、脂蛋白代謝、脂肪細胞分化等，其可調節(jié)

9、細胞內很多脂肪代謝相關蛋白的表達，包括HSL，脂蛋白脂酶(LPL)，脂聯(lián)素等。在一項體外實驗中可發(fā)現，PPAR-γ可促進脂肪細胞ATGL的表達，并且有實驗證明用PPAR-γ激動劑羅格列酮飼喂小鼠，其ATGL和HSL的mRNA和蛋白的表達都顯著增加;最近一項實驗檢測到，在3T3-L1脂肪細胞中，TNF-α能明顯降低ATGL mRNA的表達，并呈時間和劑量依賴，并且此項實驗中同樣檢測到了胰島素在對ATGL的基因表達調控上和TNF-α有類似作

10、用。有研究指出，ATGL可表達于肝臟并通過增強甘油三酯水解活性而促進游離脂肪酸的釋放和氧化，改善肝臟的脂質代謝，減輕脂肪肝。因此，ATG與NAFLD的內在聯(lián)系是近年來廣大學者研究的熱點。
　　 目前，用于治療NAFLD的藥物主要涉及胰島素增敏劑、抗氧化劑、肝細胞保護劑、減肥藥、調脂藥等方面，因高脂血癥是NAFLD發(fā)生的重要血清學基礎，故調脂藥物在NAFLD的預防和治療中的作用也引起了人們的關注。研究調脂藥物對ATGL的基因調控作

11、用可能為今后治療NAFLD提供了新的思路。
　　 第一部分NAFLD大鼠血清ATGL酶活性及TNF-α水平的變化分析
　　 目的:以高脂飼料建立非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型，檢測在大鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展的過程中血清脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL)酶活性與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的變化，以及ATGL與TNF-α的關系，從而更好地了解非酒精性脂肪肝病的發(fā)病機理。
　　 方法:78只7周齡雄性SD大

12、鼠(210-230g)隨機分為正常對照組（15只）和NAFLD模型組（63只）。以高脂飼料喂養(yǎng)NAFLD模型組大鼠，普通飼料喂養(yǎng)正常對照組大鼠。25g/鼠／天，自由飲水，維持喂養(yǎng)12周。于12周末，將所有大鼠禁食不禁水12小時后，由內眥采血2ml，檢測血清甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，谷丙轉氨酶(ALT)，谷草轉氨酶(AST)及空腹血糖(FBG)。同時用高度敏感的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，檢測血清脂肪組織甘油三酯脂酶(

13、ATGL)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。以10％水合氯醛(0.5ml/100g)對大鼠行腹腔麻醉，處死正常對照組大鼠2只和NAFLD組3只，取肝臟行病理學檢測。
　　 結果:
　　 1.經高脂飼料持續(xù)性喂養(yǎng)12周后，發(fā)現NAFLD模型組大鼠出現肥胖，腹部脂肪增多，且血清TG、TC、FBG、ALT、AST較正常對照組明顯升高，病檢時發(fā)現模型組大鼠肝臟增大、肝內脂質沉積并伴有肝組織大泡性脂肪變性及肝小葉內和匯管區(qū)炎癥

14、細胞浸潤及不同程度的肝細胞壞死等脂肪肝特征性病理改變。該模型與人類肥胖和／或糖尿病、高脂血癥所致NASH的病理學改變極其相似，故從血清學和病理學上證實造模成功;
　　 2.造模12周后，發(fā)現模型組大鼠血清TNF-α水平較對照組明顯升高，ATGL酶濃度顯著下降;
　　 3.在大鼠NAFLD發(fā)生發(fā)展的過程中，血清TNF-α與ATGL呈高度負相關。
　　 結論:
　　 1.高脂飼料維持飼養(yǎng)12周后可成功構建NA

15、FLD大鼠模型;
　　 2.在NAFLD大鼠模型中，TNF-α呈高水平狀態(tài)，而ATGL酶活性降低，且兩者間呈高度負相關，這提示在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中TNF-α與ATGL可能發(fā)揮著重要作用。
　　 第二部分辛伐他汀和非諾貝特對NAFLD大鼠ATGL mRNA表達及酶活性的影響
　　 目的:以高脂飼料建立非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型，觀察辛伐他汀和非諾貝特對大鼠NAFLD的治療效果及其對肝臟組織脂肪組

16、織甘油三酯脂酶(ATGL) mRNA的表達、血清ATGL酶活性及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。從而進一步完善NAFLD的發(fā)病機制及探索其治療方法。
　　 方法:78只7周齡雄性SD大鼠(210-230g)隨機分為正常對照組（15只）和NAFLD模型組（63只）。以高脂飼料喂養(yǎng)NAFLD模型組大鼠，普通飼料喂養(yǎng)正常對照組大鼠。25g/鼠／天，自由飲水，維持喂養(yǎng)12周后，從血清學和病理學上證實造模成功后，將余下的模型組大

17、鼠均分為4組:(1)NAFLD模型對照組15只，(2)辛伐他汀治療組15只，(3)非諾貝特治療組15只，(4)飲食治療組15只。對大鼠行灌胃治療，其中，給予辛伐他汀治療組大鼠:辛伐他汀4mg·kg-1·d-1;給予非諾貝特治療組大鼠:非諾貝特40 mg·kg-1·d-1;給予飲食治療組等量生理鹽水。16周末，以10％水合氯醛(0.5mg/100g)麻醉所有大鼠，經下腔靜脈放血處死所有動物，檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙

18、轉氨酶(ALT)及谷草轉氨酶(AST)、空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。稱取各組大鼠肝濕重，計算肝指數，并通過病理學檢測觀察各組大鼠肝臟病理變化。同時用高度敏感的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，檢測血清脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL)及腫瘤壞死因子-α（TNF-(α)，另外，通過聚合酶鏈式擴增反應檢測各組大鼠肝臟中脂肪組織甘油三酯脂酶(ATGL) mRNA的表達情況。
　　 結果:
　　

19、1.經高脂飼料持續(xù)性喂養(yǎng)12周后，NAFLD模型組大鼠出現肥胖，腹部脂肪增多，高脂血癥，肝功能異常，且肝臟增大、肝內脂質沉積并伴有肝組織大泡性脂肪變性及肝小葉內和匯管區(qū)炎癥細胞浸潤及不同程度的肝細胞壞死等脂肪肝特征性病理改變?？崭寡浅噬呲厔?。該模型與人類肥胖和／或糖尿病、高脂血癥所致NASH的病理學改變極其相似，故從血清學和病理學上證實造模成功;
　　 2.經辛伐他汀和非諾貝特灌胃治療4周后，與NAFLD模型對照組相比，兩藥

20、物治療組TG、TC、FBG、ALT、AST、BUN、Scr明顯下降，肝臟體積減小，肝臟病理檢測可見脂質沉積狀態(tài)減輕，炎癥細胞浸潤減少;
　　 3.經4周灌胃治療后，兩藥物組大鼠TNF-α水平較NAFLD模型對照組大鼠明顯下降，且兩藥物組大鼠肝臟ATGL mRNA表達上調及血清ATGL酶濃度顯著增強，而兩藥物組組間差異無統(tǒng)計學意義;
　　 4.飲食治療組大鼠脫離高脂飲食4周后，血清TC、ALT較模型對照組大鼠明顯下降，但與

21、兩藥物組相比仍存在差異，病理顯示飲食治療組大鼠肝臟脂質沉積情況雖較模型組有所好轉，但仍有小泡性脂肪滴，伴少量炎細胞浸潤和壞死肝細胞，而血清TNF-α水平及ATGL mRNA表達及酶活性較模型組無明顯差異;
　　 5.在NAFLD發(fā)生發(fā)展的過程中，血清TNF-α與ATGL呈高度負相關。
　　 結論:
　　 1.在大鼠NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，TNF-α呈高水平狀態(tài)，可能通過下調ATGL mRNA表達進一步影響AT