紫杉醇體外誘導大鼠C6腦膠質瘤細胞凋亡及其分子機制研究.pdf

1、目的： 1．探討紫杉醇的不同藥物濃度、作用時限與大鼠C6腦膠質瘤細胞凋亡過程的關系，建立紫杉醇誘導大鼠C6腦膠質瘤細胞株凋亡的細胞研究模型。 2．分析大鼠C6腦膠質瘤細胞在紫杉醇不同時限作用后，細胞抑制率、細胞周期和細胞凋亡相關的熱點分子Bcl-2家族BH3-only蛋白Puma、Noxa、Bim的mRNA水平的表達變化，以及BH3-only蛋白與p53 mRNA水平表達相互之間的關系，初步探討紫杉醇誘導大鼠C6腦膠質瘤

2、細胞凋亡的機制。 方法： 1．細胞培養(yǎng)及藥物濃度和作用時限的確定：大鼠C6腦膠質瘤細胞株KG-099的維持及擴大培養(yǎng)；用臺盼藍染色后檢測KG-099細胞活率，并選擇細胞活率在90%以上進行傳代培養(yǎng)：MTT法檢測紫杉醇對細胞的增殖抑制作用，并選擇合適的藥物濃度進行下一步實驗。 2．細胞凋亡的觀察：熒光倒置顯微鏡下觀察0．1μmol/L紫杉醇作用C6腦膠質瘤細胞后，不同時間點（4、8、16、24、48h）細胞生長情況

3、和細胞形態(tài)學改變；選取對數(shù)生長期的C6腦膠質瘤細胞用0．1μmol/L紫杉醇以不同時間點（4、8、16、24、48h）進行誘導，用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。 3．細胞凋亡機制的研究：SYBR Green Real-Time RT-PCR法檢測0．1μmol/L紫杉醇的不同時間點（4、8、16、24、48h）作用C6腦膠質瘤細胞后Puma、Noxa、Bim、p53的mRNA水平的表達。 4．分析上述指標在細胞凋亡過程中

4、的變化及其相互關系。 結果： 1．紫杉醇對大鼠C6腦膠質瘤細胞具有明顯增殖抑制作用，隨紫杉醇濃度的增加細胞抑制率逐漸升高，48h細胞IC50約為0．1μmol/L；細胞抑制率隨紫杉醇作用時間的延長逐漸升高，48h細胞抑制率為51．73%。 2．紫杉醇誘導大鼠C6腦膠質瘤細胞后生長情況和形態(tài)學變化：細胞從貼壁好、生長密集、折光性好向貼壁少，細胞收縮體積變小，數(shù)目減少、折光性差，出現(xiàn)壞死崩解細胞改變，個別細胞可見到核

5、碎裂，呈凋亡形態(tài)學改變。 3．紫杉醇誘導大鼠C6腦膠質瘤細胞后細胞凋亡的分析：流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，隨著紫杉醇誘導時間的延長，G2/M期細胞逐漸增加，S期細胞逐漸減少；0．1μmol/L紫杉醇作用大鼠C6腦膠質瘤細胞后24h檢測到明顯凋亡峰，凋亡率為11．34%。 4．紫杉醇誘導大鼠C6腦膠質瘤細胞后凋亡信號轉導分子Puma、Noxa、Bim、p53的mRNA水平的表達：SYBR Green Real-Time R

6、T-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠C6腦膠質瘤細胞中Puma、Noxa、Bim和p53 mRNA均可表達；在紫杉醇誘導下，Puma、Noxa和p53 mRNA表達隨誘導時間延長呈增高趨勢，Bim mRNA表達并不受紫杉醇誘導影響。 結論： 1．紫杉醇對大鼠C6腦膠質瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈劑量、時間依賴性。 2．紫杉醇可誘導腦膠質瘤細胞的凋亡；同時可使大鼠C6腦膠質瘤細胞阻滯在G2/M期，減少進入S期的細胞數(shù)。