甘油誘導(dǎo)急性腎損傷大鼠腎組織中Megalin和FUT8的表達(dá)及山莨菪堿干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:過(guò)度訓(xùn)練引起橫紋肌溶解(rhabdomyolysis，RM)，可導(dǎo)致急性腎損傷(acutekidneyinjury,AKI)。而急性腎損傷作為腎臟內(nèi)科最重要的急危重癥，對(duì)其有效治療是世界性難題。如何防治并早期干預(yù)過(guò)度訓(xùn)練所致急性腎損傷已成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的重要課題。
　　 在過(guò)度訓(xùn)練引起橫紋肌溶解導(dǎo)致急性腎損傷的發(fā)病過(guò)程中，肌紅蛋白的腎毒性是引起急性腎損傷的重要原因。而肌紅蛋白的吸收依靠的是腎小管近

2、端的Megalin糖蛋白，但其具體的致病分子機(jī)制及早期干預(yù)處理的分子靶位點(diǎn)研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用甘油誘導(dǎo)大鼠橫紋肌溶解致急性腎損傷模型，觀察其生化指標(biāo)的變化，檢測(cè)腎組織Megalin及對(duì)Megalin有調(diào)節(jié)翻譯后修飾功能的a-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)的表達(dá)變化以及山莨菪堿對(duì)上述指標(biāo)變化的影響，為進(jìn)一步研究AKI的發(fā)病機(jī)制，并尋找早期藥物干預(yù)靶位點(diǎn)和有效的防治措施提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法:(1)健康雄性SD

3、大鼠42只，體重200-220g，采用完全隨機(jī)分組方式分為3組:對(duì)照組(Control，CN,n=6)、急性腎損傷模型組(acutekidneyinjury,AKI，n=18)、山莨菪堿干預(yù)組(anisodamine，AD，n=18)。AKI組和AD組根據(jù)甘油作用時(shí)間又分為三個(gè)亞組即1h、6h組和24h組，每組6只大鼠。(2)采用給大鼠雙后肢肌肉注射甘油生理鹽水建立橫紋肌溶解致急性腎損傷模型。(3)使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)生化指標(biāo)血肌酐(S

4、cr)、尿素氮(BUN)及肌酸激酶(CK)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清肌紅蛋白Mb;應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變;應(yīng)用免疫組化和圖像分析檢測(cè)腎組織中Megalin和FUT8的表達(dá);應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)FUT8的表達(dá)。(4)統(tǒng)計(jì)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間同一時(shí)間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，相

5、關(guān)分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，以p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:(1)血生化指標(biāo):AKI組肌注甘油6小時(shí)、24小時(shí)后血清BUN、Scr、Mb與CN組比較均明顯升高(p＜0.05），于24小時(shí)后達(dá)到高峰(p＜0.05);血清CK于肌注甘油1小時(shí)后即明顯升高，6小時(shí)后達(dá)到高峰(p＜0.05)，24小時(shí)后回落;AD亞組與同期AKI組比較，各指標(biāo)水平均顯著降低(p＜0.05)。(2)光鏡觀察顯示:CN組大鼠腎組織未見(jiàn)明顯

6、病理學(xué)改變;隨著甘油作用時(shí)間的延長(zhǎng)，AKI組病理?yè)p傷逐漸加重，于24h組可見(jiàn)大量腎小管上皮細(xì)胞胞核深染及固縮，腎小管上皮細(xì)胞壞死、崩解，不規(guī)整脫落，管腔內(nèi)出現(xiàn)大量由蛋白、脫落的上皮細(xì)胞碎片形成的管型，間質(zhì)可見(jiàn)毛細(xì)血管充血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管塌陷閉塞。與AKI組比較，AD亞組各時(shí)點(diǎn)病理學(xué)改變均有所減輕。(3)免疫組化結(jié)果:①M(fèi)egalin的表達(dá):陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞胞漿著色為深棕色粗顆粒狀，著色部位主要見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿近基底膜部

7、位，腎小球及間質(zhì)偶見(jiàn)表達(dá)。CN組大鼠腎組織中Megalin有弱表達(dá)，AKI組隨甘油作用時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，肌注甘油1h后Megalin有少量表達(dá)(p＜0.05），6h后表達(dá)量及面積明顯增強(qiáng)(p＜0.05)，24h后達(dá)高峰(p＜0.05)。AD亞組均較同期AKI組表達(dá)減弱(p＜0.05)。②FUT8的表達(dá):陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞胞漿著色為棕黃色，主要見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿近基底膜部位，腎小球及間質(zhì)偶見(jiàn)表達(dá)。CN組大鼠腎組織中FUT8有弱表達(dá)

8、，AKI組隨甘油作用時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增加(p＜0.05），于肌注甘油24h后達(dá)到高峰(p＜0.05），AD亞組表達(dá)均弱于同期AKI組(p＜0.05)。對(duì)圖像進(jìn)行半定量分析，各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。(4)WesternBlot結(jié)果:在內(nèi)參GAPDH表達(dá)量基本一致的情況下，CN組大鼠FUT8條帶顏色較淺，AKI組隨甘油作用時(shí)間的延長(zhǎng)，條帶顏色逐漸加深（p＜0.05），于肌注甘油24h后條帶最深（p＜0.05）。AD亞組

9、均較同期AKI組條帶顏色淺，對(duì)其進(jìn)行半定量分析，各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(5)相關(guān)性分析:血清Mb水平與BUN、Scr呈顯著正相關(guān)(r=0.872，p＜0.05;r=0.716，p＜0.05);與腎組織Megalin、FUT8蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.843，p＜0.05;r=0.802，p＜0.05);Megalin與FUT8蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.965，p＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.