他莫昔芬抑制巨噬細胞FABP4表達——糖皮質激素受體和過氧化物酶體增殖物激活受體γ依賴型機制.pdf

1、心血管疾病已經成為人類健康與生命的重大威脅。冠心病是心血管疾病中最常見的一種，而動脈粥樣硬化(AS)則是造成冠心病的主要病理之一。動脈粥樣硬化的發(fā)生與多種因素有關，如血管內皮損傷，單核細胞和巨噬細胞聚集，血管平滑肌細胞增生以及多種趨化因子和細胞因子的產生等。其中，單核細胞衍生的巨噬細胞轉化成泡沫細胞是動脈粥樣硬化形成的起始與關鍵步驟。
　　脂肪酸結合蛋白(FABPs)是一組同源小分子細胞胞漿蛋白，分子量為14-15 kD，能夠結合

2、疏水性脂類并對其進行細胞內亞組織轉運。脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（FABP4，又稱為A-FABP或aP2）是細胞內FABP家族成員之一。FABP4廣泛存在于各種正常組織、細胞中，但在脂肪組織和巨噬細胞中高表達。FABP4能夠可逆性結合飽和及不飽和長鏈脂肪酸，促進脂肪酸代謝和轉運。此外，F(xiàn)ABP4在其他生物學過程中尤其是代謝綜合征的許多方面具有重要作用。FABP4基因敲除小鼠可以抑制由高脂肪飲食誘導的動脈粥樣硬化發(fā)展，在巨噬細胞中誘導FAB

3、P4高表達會促進泡沫細胞形成，表明FABP4在動脈粥樣硬化的發(fā)展中也具有重要作用。
　　他莫昔芬（tamoxifen）是一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)，同時也是抗血管再生因子和蛋白激酶C的抑制劑。在體內細胞色素P4502D6(CYP2D6)的作用下，tamoxifen可以被羥基化為四羥他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen或4-OH-tamoxifen），四羥他莫昔芬具有更強的SERM活性。過去20多年中，作為化療

4、藥tamoxifen在臨床上用于治療早期和晚期高表達雌激素受體的乳腺癌，同時大量的臨床前和臨床試驗證明tamoxifen具有心血管保護功能。例如,tamoxifen可以降低絕經后婦女心肌梗死的發(fā)生率以及降低頸總動脈的內膜厚度;還可以增加男性晚期動脈粥樣硬化內皮依賴性血流調控的血管擴張;在動物模型中，tamoxifen可以降低雄性野生型小鼠和apoE-/-小鼠以及通過手術絕經的雌猴體內由高脂肪飲食誘導的動脈損傷與動脈粥樣硬化的發(fā)生。Tam

5、oxifen雖具有心血管保護功能，但其作用的具體分子機制尚未完全清楚。因此本論文研究tamoxifen和4-OH-tamoxifen能否通過抑制FABP4表達以達到減少泡沫細胞形成從而抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的目的，同時我們將深入研究tamoxifen作用于FABP4表達的具體分子機制。
　　首先，分離來自于雌性和雄性野生型小鼠腹腔的原代巨噬細胞，在tamoxifen和4-OH-tamoxifen作用下，發(fā)現(xiàn)tamoxifen和4-O

6、H-tamoxifen抑制小鼠原代巨噬細胞FABP4蛋白表達且不存在性別依賴現(xiàn)象。前期研究成果表明地塞米松（Dex）、匹伐他汀(pitavastatin)與dexamethasone結合、激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)等皆誘導FABP4表達，為此，研究tamoxifen和4-OH-tamoxifen對上述誘導作用的拮抗效果。通過Western blot檢測證明了tamoxifen和4-OH-tamoxifen能有效的拮抗

7、上述誘導作用。在轉錄水平上，通過Northern blot發(fā)現(xiàn)tamoxifen和4-OH-tamoxifen抑制巨噬細胞FABP4 mRNA表達，進一步對FABP4啟動子活性進行分析，探究tamoxifen和4-OH-tamoxifen下調FABP4表達的具體分子機制。通過分析，發(fā)現(xiàn)FABP4啟動子區(qū)域存在糖皮質激素受體(GR)的正負調節(jié)元件(pGRE和nGRE)以及PPARγ的兩個潛在結合元件（PPRE1和PPRE2）。雙熒光素酶活

8、性實驗和EMSA實驗結果證明，tamoxifen和4-OH-tamoxifen通過激活nGRE活性并增加核轉錄因子GR與nGRE結合同時抑制PPRE1活性以及核轉錄因子PPARγ與PPRE結合，從而下調FABP4啟動子活性，抑制FABP4轉錄與表達。之后，利用Western blot結合熒光標記定位實驗證明，tamoxifen和4-OH-tamoxifen不影響GR表達，但是可以抑制由dexamethasone誘導的GR核轉移。

9、　　此外，檢測tamoxifen和4-OH-tamoxifen對FABP4表達的抑制作用在小鼠體內和人血單核細胞衍生的巨噬細胞中是否存在。分別喂食雌性和雄性apoE-/-小鼠含有tamoxifen的高脂食物（0.5％的膽固醇和21％的脂肪）一個月，之后分別收集小鼠腹腔巨噬細胞和脂肪組織，檢測FABP4蛋白表達的變化情況。結果與體外實驗一致，tamoxifen以非性別依賴的方式抑制巨噬細胞和脂肪組織中FABP4蛋白表達。同時，從志愿者身上

10、獲取血液并提取白細胞，其衍生的巨噬細胞中FABP4蛋白表達同樣被tamoxifen和4-OH-tamoxifen所抑制，與小鼠體內外實驗結果一致。
　　為研究tamoxifen是否可以抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，喂食雌性apoE-/-小鼠含有tamoxifen的高脂食物（雄性小鼠已有報道）16周后，完整分離出其主動脈進行油紅O染色后觀察斑塊的形成情況，發(fā)現(xiàn)tamoxifen確實可以抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。此外，通過FABP4