LXRs激動(dòng)對(duì)PPARy轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、脂肪組織能分泌多種蛋白質(zhì)激素和細(xì)胞因子(統(tǒng)稱脂肪因子,Adipokines)。肥胖時(shí)脂肪組織分泌的脂肪因子譜發(fā)生變化,如脂聯(lián)素(Adiponectin)分泌減少,內(nèi)脂素(Visfatin)、瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)分泌增加,并伴隨著脂肪炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等分泌增加,最終的結(jié)果是導(dǎo)致胰島

2、素抵抗(InsulinResistance,IR),增加了代謝綜合征(Metabolic Syndrome,MS)、2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。以脂肪因子為切入點(diǎn)研究肥胖和MS的關(guān)系已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。
　　 過氧化物酶增殖物活化受體γ(Peroxisome proliferator activated receptorgamma,PPARγ)選擇性地在脂肪組織中高表達(dá),因其對(duì)胰島素敏感性的調(diào)節(jié)而備受矚目。眾多的脂肪因子

3、如Adiponectin、Visfatin、TNF-α和IL-6等的表達(dá)均受到PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),激活PPARγ增加胰島素敏感性的機(jī)制主要與其調(diào)節(jié)脂肪因子的產(chǎn)生有關(guān)。肝X受體(Liver X receptors,LXRs)也在脂肪組織高表達(dá),其在調(diào)節(jié)糖、脂代謝方面的作用與PPARγ存在重疊,但其對(duì)脂肪因子表達(dá)的作用未見報(bào)道。在肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),LXRs激動(dòng)能夠抑制PPARα信號(hào)通路進(jìn)而抑制脂肪酸分解代謝相關(guān)基因的表達(dá).但在脂肪細(xì)胞中,LXR

4、s激動(dòng)是否影響PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪因子的表達(dá)尚無研究?；谥疽蜃优cIR的密切關(guān)系以及PPARγ在調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)中的重要地位,研究LXRs激動(dòng)對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)的作用及機(jī)制,對(duì)于評(píng)價(jià)LXRs對(duì)機(jī)體胰島素敏感性的作用以及LXRs激動(dòng)劑作為拮抗MS新型藥物的前景具有重要意義。
　　 第一部分 LXRs激動(dòng)對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)的作用。
　　 目的:觀察LXRs激動(dòng)及LXRα表達(dá)敲低對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄

5、調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)的作用。
　　 方法:將3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)“Cocktail”誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。首先利用Real-time RT-PCR和Western blot方法觀察了脂肪細(xì)胞分化過程中LXRs和PPARγ的表達(dá)變化；其次在成熟脂肪細(xì)胞中利用Real-time RT-PCR、Western blot和ELISA法觀察了PPARγ激動(dòng)劑Pioglitazone3μM存在或不存在時(shí),LXRs激動(dòng)劑T0901317

6、以0、0.1、1.0和10.0μM濃度梯度刺激脂肪細(xì)胞對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪因子Adiponectin、Visfatin以及LPS2μg／ml刺激誘導(dǎo)的脂肪炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)和分泌的作用,并觀察了以逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shRNA-LXRα轉(zhuǎn)染特異性敲低LXRα表達(dá)后上述脂肪因子表達(dá)的變化；最后以Real-time RT-PCR和Western blot方法研究了LXRs激動(dòng)對(duì)PPARγ基因本身表達(dá)的作用。
　　 結(jié)果

7、:
　　 (1)在脂肪細(xì)胞分化成熟過程中,PPARγ和LXRα mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸增加,在誘導(dǎo)第4日(DAY4),二者的表達(dá)較誘導(dǎo)前有顯著增加(P<0.05 VS DAY0),至誘導(dǎo)第8-10日達(dá)到高峰,而LXRβ表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化過程中無明顯變化；
　　 (2)T0901317濃度依賴性地抑制Adiponectin和Visfatin mRNA和蛋白表達(dá),并濃度依賴性地拮抗了Pioglitazone誘導(dǎo)的Adip

8、onectin和Visfatin mRNA和蛋白表達(dá)增加,在1.0及10.0μM作用顯著(P<0.05 VS DMSO／Pioglitazone)；但在脂肪炎癥因子的表達(dá)上,T0901317濃度依賴性地下調(diào)了LPS刺激誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6mRNA表達(dá)和蛋白分泌,同時(shí)加入Pioglitazone,TNF-α和IL-6mRNA表達(dá)和蛋白分泌在T0901317各濃度點(diǎn)均進(jìn)一步下降,在T0901317在1.0及10.0μM濃度與Piogl

9、itazone的協(xié)同抑制作用最顯著(P<0.05 VS LPS／LPS+Pioglitazone);(3)LXRα表達(dá)敲低后,在T0901317各濃度點(diǎn),Pioglitazone誘導(dǎo)的Adiponectin和Visfatin mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P<0.05 VS shRNA-Control+Pioglitazone組),但盡管存在Pioglitazone,LPS刺激誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)和蛋白分泌在T090

10、1317各濃度點(diǎn)均增加(P<0.05 VS shRNA-Control+Pioglitazone+LPS組);
　　 (4)T0901317在1.0和10.0μM能上調(diào)PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.05 VSDMSO)。
　　 結(jié)論:在成熟脂肪細(xì)胞中,LXRs激動(dòng)能拮抗PPARγ轉(zhuǎn)錄激活脂肪因子Adiponectin和Visfatin表達(dá),但協(xié)同PPARγ對(duì)脂肪炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制作用

11、,前者可能對(duì)胰島素敏感性不利,而后者則可能改善胰島素敏感性。對(duì)LXRs激動(dòng)劑來說,如何趨利避害是亟待解決的問題,而這需要我們對(duì)LXRs激動(dòng)如何影響PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)的機(jī)制作深入研究。
　　 第二部分 LXRs激動(dòng)影響PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)的機(jī)制研究。
　　 目的:明確LXRs激動(dòng)拮抗PPARγ轉(zhuǎn)錄激活活性,但協(xié)同PPARγ抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的主要機(jī)制。
　　 方法:利用啟動(dòng)子報(bào)告基因PPRE—L

12、uc和KB-Luc活性分別代表PPARγ轉(zhuǎn)錄激活活性和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)和凝膠遷移滯后試驗(yàn)(ElectrophoreticMobility Shift Assay,EMSA),觀察HEK293細(xì)胞中LXRα、PPARγ、PPRE-Luc／KB—Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及T0901317濃度梯度刺激對(duì)PPRE-Luc和KB-Luc活性的影響以及脂肪細(xì)胞中LXRs激動(dòng)或LXRα表達(dá)敲低對(duì)PPARγ和NF-κB的DNA結(jié)合活性的

13、作用；并予RXRα(維甲酸X受體α)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,觀察補(bǔ)充RXRα是否能逆轉(zhuǎn)LXRs激動(dòng)對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄激活活性以及PPARγ轉(zhuǎn)錄激活脂肪因子表達(dá)的拮抗作用；并在脂肪細(xì)胞中以Western blot法觀察LXRs激動(dòng)或LXRα表達(dá)敲低對(duì)LPS刺激的NF—KB信號(hào)通路活性的作用。
　　 結(jié)果:
　　 (1)在HEK293細(xì)胞中,T0901317濃度依賴性地拮抗了PPARγ及其激動(dòng)劑Pioglitazone誘導(dǎo)的PPRE—L

14、uc活性增加(P<0.05 VS DMSO／Pioglitazone),但能濃度依賴性地協(xié)同Pioglitazone對(duì)κB-Luc活性的抑制作用,在1.0和10.0μM作用顯著(P<0.05 VS LPS+Pioglitazone)；
　　 (2)在脂肪細(xì)胞中,T0901317拮抗了Pioglitazone誘導(dǎo)的PPARγ與PPRE結(jié)合活性增加,但協(xié)同了Pioglitazone對(duì)NF-κB的DNA結(jié)合活性的抑制作用；LXRα表達(dá)

15、敲低后,Pioglitazone誘導(dǎo)的PPARγ與PPRE的結(jié)合活性進(jìn)一步增加,但Pioglitazone和T0901317對(duì)NF-κB的DNA結(jié)合活性的協(xié)同抑制作用降低；
　　 (3)補(bǔ)充RXRα能夠逆轉(zhuǎn)LXRs激動(dòng)對(duì)PPRE-Luc活性的抑制作用,并基本恢復(fù)脂肪細(xì)胞中Adiponectin和Visfatin mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05 VS pcDNA3.1);
　　 (4)在脂肪細(xì)胞中,Pioglitazon

16、e和T0901317能夠單獨(dú)或協(xié)同抑制LPS刺激的IKBα磷酸化和磷酸化NF-κBp65核轉(zhuǎn)位(P<0.05 VS LPS),進(jìn)而抑制NF-κB通路活性；LXRα表達(dá)敲低后,Pioglitazone和T0901317對(duì)NF-κB通路活性的協(xié)同抑制作用明顯降低(P<0.05 VS shRNA-Control)。
　　 結(jié)論:脂肪細(xì)胞中LXRs激動(dòng)主要通過競(jìng)爭(zhēng)RXRα拮抗PPARγ轉(zhuǎn)錄激活活性,進(jìn)而抑制PPARγ轉(zhuǎn)錄激活脂肪因子表達(dá)