地錦(Parthenocissus tricuspidata)的遺傳轉(zhuǎn)化及抑菌活性研究.pdf

1、地錦(Parthenocissus tricuspidata)為葡萄科(Vitaceae)地錦屬(Parthenocissus)多年生大型落葉木質(zhì)藤本植物，集綠化、環(huán)境保護(hù)、藥用價(jià)值為一體，開發(fā)利用前景非常廣闊。為了進(jìn)一步有效地利用及增加它的適應(yīng)性，本論文對(duì)地錦的遺傳轉(zhuǎn)化及其抑菌活性進(jìn)行了初步研究。
　　 利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)對(duì)地錦進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。所轉(zhuǎn)外源目的基因?yàn)楦珊祽?yīng)答因子結(jié)

2、合蛋白DREB基因，克隆自擬南芥，受干旱應(yīng)答基因啟動(dòng)子rd29Bp驅(qū)動(dòng)。將此基因與pCAMBIA2301重組構(gòu)建得到植物表達(dá)載體p2326。p2326攜報(bào)告基因p-葡萄糖苷酸酶基因(gus)和選擇基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)。然后將p2326導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，對(duì)地錦愈傷組織及外植體莖段進(jìn)行轉(zhuǎn)化。經(jīng)3-4輪卡那霉素選擇培養(yǎng)后，PCR及GUS組織染色驗(yàn)證，表明成功獲得了轉(zhuǎn)基因愈傷組織。
　　 對(duì)地錦愈傷組織進(jìn)行耐鹽

3、及脯氨酸含量測(cè)定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因愈傷組織與非轉(zhuǎn)基因愈傷組織相比，對(duì)高鹽的耐受力有較大提高。在250 mM NaC1的繼代培養(yǎng)基中，攜DREB基因的愈傷組織能夠存活20 d以上，而對(duì)照在10 d后大多數(shù)褐化死亡。高鹽脅迫時(shí)轉(zhuǎn)基因材料脯氨酸含量高于對(duì)照，并能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間。
　　 研究還發(fā)現(xiàn)，來自室外自然生長(zhǎng)的地錦莖、葉，對(duì)根癌農(nóng)桿菌有極強(qiáng)的抑制作用。因此，對(duì)地錦的抑菌作用進(jìn)行初步研究。
　　 對(duì)一年中不同時(shí)期(分別采于4

4、月、8月、12月)的地錦莖、葉進(jìn)行抑菌活性初步研究。結(jié)果表明，12月份地錦葉片對(duì)所選細(xì)菌抑制作用最強(qiáng)。然后對(duì)其進(jìn)行分溶劑萃取。分別用極性遞增的有機(jī)溶劑依次提取地錦中的有效成分、逐級(jí)分離、濃縮干燥，得到石油醚部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部等不同極性溶劑萃取物。選擇革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌共5種對(duì)得到的各部分粗提物分別做抑菌實(shí)驗(yàn)，表明正丁醇部的抑菌活性最強(qiáng)，水部提取物有一定抑制作用，而石油醚部、乙酸乙酯部沒有表現(xiàn)出明顯抑菌作用。
　　

5、地錦正丁醇提取物對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、短小芽孢桿菌、農(nóng)桿菌及酵母菌的最低抑制濃度(MIC)分別為0.25，0.3，0.25，0.3，1g/mL。其抑菌活性隨著濃度增加而增強(qiáng)，而且抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)地錦所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)不僅對(duì)無耐藥性的細(xì)菌具有抑制作用，而且還對(duì)某些耐藥性細(xì)菌具有抑制作用。目前，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性已成為全球關(guān)注的問題，尋找新型抗生素已迫在眉捷，地錦抑菌物質(zhì)的研究為新抗菌藥物的研制開發(fā)提供了