Lamininγ2在肝外膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移中作用的初步研究.pdf

1、一、背景
　　肝外膽管癌是起源于肝外膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，由于其早期就可發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。近年來(lái)其發(fā)病率有增高趨勢(shì)。手術(shù)切除是目前治療的主要方法，然而許多病人在行手術(shù)之前就已經(jīng)發(fā)生了淋巴結(jié)侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使手術(shù)無(wú)法達(dá)到根治;此外還有許多病人，即便是采取了手術(shù)切除，但術(shù)后2年內(nèi)就出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，這些均嚴(yán)重影響了病人的預(yù)后。因此，尋找新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的靶點(diǎn)和預(yù)后分析的靶點(diǎn)十分必要。
　　層粘連蛋白332(laminin3

2、32)，是一種大分子量的糖蛋白，由α3、β3、γ2三條鏈構(gòu)成的異源性三聚體。目前已知的層粘連蛋白家族中有15個(gè)亞型，它們的基因序列和結(jié)構(gòu)相似，不同的細(xì)胞表達(dá)不同的層粘連蛋白亞型，laminin332是唯一在上皮細(xì)胞廣泛分布的亞型，它是上皮組織基底膜重要組成部分，通過(guò)與其受體結(jié)合在介導(dǎo)細(xì)胞與基底膜粘附及細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)、分化中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。從層粘連蛋白的結(jié)構(gòu)來(lái)看，lamininγ2鏈?zhǔn)莑aminin332特有組成成分，且該鏈能夠以

3、單體形式分泌，許多研究把lamininγ2作為laminin332檢測(cè)的代表。文獻(xiàn)報(bào)道在許多腫瘤中存在lamininγ2的過(guò)表達(dá)，并且與侵襲轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。在一些研究中把lamininγ2在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)作為判斷病人預(yù)后的標(biāo)志。既往研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽管癌中l(wèi)amininγ2的表達(dá)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化以及病人預(yù)后相關(guān)，但由于肝外膽管癌發(fā)病率占膽管癌總數(shù)的80％-90％，并且兩者的形態(tài)學(xué)及發(fā)病機(jī)理不同，目前l(fā)amininγ2在肝外膽管癌中的表達(dá)及

4、作用未見(jiàn)報(bào)道，本次實(shí)驗(yàn)將圍繞這一方面做初步研究。
　　二、研究假說(shuō)
　　Lamininγ2在肝外膽管癌細(xì)胞中表達(dá)升高，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，并且可能作為判斷病人預(yù)后的標(biāo)志，為臨床抗腫瘤轉(zhuǎn)移靶向性治療和預(yù)后分析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　三、材料方法
　　1、收集2005-2010年西南醫(yī)院肝膽外科行膽管癌切除術(shù)病人的病例資料和組織標(biāo)本。其中肝外膽管癌72例、癌旁16例、炎性肝外膽管8例、膽管腺瘤5例;收集72例肝外膽

5、管癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織28例和肝轉(zhuǎn)移組織7例。來(lái)源于肝外膽管癌患者的細(xì)胞株QBC939為西南醫(yī)院肝膽外科自建。
　　2、通過(guò)免疫組化染色，對(duì)比肝外膽管癌、癌旁、炎性膽管、膽管腺瘤組織中l(wèi)amininγ2表達(dá)差異;分析lamininγ2在肝外膽管癌中的表達(dá)情況與腫瘤臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性;對(duì)比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和肝轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶組織中l(wèi)amininγ2表達(dá)的差異。
　　3、隨訪72例肝外膽管癌病人的死亡時(shí)間和/或腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間，根據(jù)

6、手術(shù)日期計(jì)算出病人術(shù)后總生存時(shí)間和無(wú)瘤存活時(shí)間。分別使用Kaplan-Meier和Cox模型，分析肝外膽管癌中l(wèi)amininγ2表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系。
　　4、應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)肝外膽管癌細(xì)胞(QBC939)lamininγ2表達(dá)，采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)lamininγ2對(duì)肝外膽管癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。
　　四、結(jié)果:
　　1、Lamininγ2在肝外膽管癌中存在兩種表達(dá)類型

7、:腫瘤細(xì)胞胞漿表達(dá)和/或腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá);72例肝外膽管癌組織中，28例腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)染色陽(yáng)性，24例腫瘤細(xì)胞胞漿染色陽(yáng)性，16例既有腫瘤細(xì)胞胞漿染色陽(yáng)性又有腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)染色陽(yáng)性;16例癌旁、5例肝外膽管腺瘤及8例炎性膽管上皮細(xì)胞lamininγ2染色均為陰性。將lamininγ2表達(dá)分為腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)組和腫瘤細(xì)胞胞漿表達(dá)組，分別與腫瘤的臨床病理學(xué)參數(shù)行相關(guān)性分析提示:腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)lamininγ2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p

8、=0.01);腫瘤細(xì)胞胞漿lamininγ2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p=0.02;p=0.01);28例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中，17例lamininγ2腫瘤細(xì)胞胞漿染色陽(yáng)性，高于其在原發(fā)灶胞漿表達(dá)水平(P=0.01);7例肝轉(zhuǎn)移灶組織中，4例lamininγ2腫瘤細(xì)胞胞漿染色陽(yáng)性，高于其在原發(fā)灶胞漿表達(dá)水平。上述結(jié)果提示:肝外膽管癌中l(wèi)amininγ2異常表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2、Kaplan-Meier模型

9、生存分析提示:肝外膽管癌細(xì)胞外基質(zhì)或胞漿lamininγ2表達(dá)陽(yáng)性病人的術(shù)后總生存時(shí)間顯著低于lamininγ2表達(dá)陰性的病人(log-rankp=0.007;p=0.008),肝外膽管癌細(xì)胞外基質(zhì)或胞漿lamininγ2表達(dá)陽(yáng)性病人的術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間顯著早于lamininγ2表達(dá)陰性的病人(log-rankP=0.004;P=0.006)。然后我們將lamininγ2表達(dá)情況進(jìn)行分組:細(xì)胞外基質(zhì)和胞漿均陽(yáng)性組;細(xì)胞外基質(zhì)陽(yáng)性、胞漿陰性

10、組;胞外基質(zhì)陰性、胞漿陽(yáng)性組;細(xì)胞外基質(zhì)和胞漿均陰性組。分析提示無(wú)論肝外膽管癌lamininγ2是哪種類型表達(dá)陽(yáng)性，其病人術(shù)后總生存時(shí)間均顯著低于lamininγ2表達(dá)陰性的病人(log-rankP=0.001);無(wú)論肝外膽管癌lamininγ2是哪種類型表達(dá)陽(yáng)性，其病人術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間均顯著早于lamininγ2表達(dá)陰性的病人(log-rankp＜0.001)。Cox模型分析提示lamininγ2表達(dá)是判斷肝外膽管癌術(shù)后病人存活時(shí)間和

11、腫瘤復(fù)發(fā)相對(duì)獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.465,95％CI=1.391-4.368,p=0.002;HR=2.679,95％CI=1.547-4.638,p＜0.001)。上述結(jié)果提示:肝外膽管癌lamininγ2異常表達(dá)可能是判斷病人預(yù)后的分子標(biāo)志。
　　3、體外實(shí)驗(yàn)中采用免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，lamininγ2表達(dá)在QBC939細(xì)胞胞漿。在QBC939細(xì)胞中，干擾lamininγ2的表達(dá)顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果提示:l