Lamininγ2在肝外膽管癌侵襲轉移中作用的初步研究.pdf

1、一、背景
　　肝外膽管癌是起源于肝外膽管上皮細胞的惡性腫瘤，由于其早期就可發(fā)生侵襲轉移，預后極差。近年來其發(fā)病率有增高趨勢。手術切除是目前治療的主要方法，然而許多病人在行手術之前就已經發(fā)生了淋巴結侵犯或遠處轉移，使手術無法達到根治;此外還有許多病人，即便是采取了手術切除，但術后2年內就出現(xiàn)腫瘤復發(fā)，這些均嚴重影響了病人的預后。因此，尋找新的抗腫瘤轉移治療的靶點和預后分析的靶點十分必要。
　　層粘連蛋白332(laminin3

2、32)，是一種大分子量的糖蛋白，由α3、β3、γ2三條鏈構成的異源性三聚體。目前已知的層粘連蛋白家族中有15個亞型，它們的基因序列和結構相似，不同的細胞表達不同的層粘連蛋白亞型，laminin332是唯一在上皮細胞廣泛分布的亞型，它是上皮組織基底膜重要組成部分，通過與其受體結合在介導細胞與基底膜粘附及細胞的遷移、生長、分化中發(fā)揮重要的生物學作用。從層粘連蛋白的結構來看，lamininγ2鏈是laminin332特有組成成分，且該鏈能夠以

3、單體形式分泌，許多研究把lamininγ2作為laminin332檢測的代表。文獻報道在許多腫瘤中存在lamininγ2的過表達，并且與侵襲轉移顯著相關。在一些研究中把lamininγ2在腫瘤細胞中的表達作為判斷病人預后的標志。既往研究發(fā)現(xiàn)，肝內膽管癌中l(wèi)amininγ2的表達與腫瘤的惡性轉化以及病人預后相關，但由于肝外膽管癌發(fā)病率占膽管癌總數(shù)的80％-90％，并且兩者的形態(tài)學及發(fā)病機理不同，目前l(fā)amininγ2在肝外膽管癌中的表達及

4、作用未見報道，本次實驗將圍繞這一方面做初步研究。
　　二、研究假說
　　Lamininγ2在肝外膽管癌細胞中表達升高，能夠促進腫瘤細胞侵襲轉移，并且可能作為判斷病人預后的標志，為臨床抗腫瘤轉移靶向性治療和預后分析提供實驗依據(jù)。
　　三、材料方法
　　1、收集2005-2010年西南醫(yī)院肝膽外科行膽管癌切除術病人的病例資料和組織標本。其中肝外膽管癌72例、癌旁16例、炎性肝外膽管8例、膽管腺瘤5例;收集72例肝外膽

5、管癌病人的淋巴結轉移組織28例和肝轉移組織7例。來源于肝外膽管癌患者的細胞株QBC939為西南醫(yī)院肝膽外科自建。
　　2、通過免疫組化染色，對比肝外膽管癌、癌旁、炎性膽管、膽管腺瘤組織中l(wèi)amininγ2表達差異;分析lamininγ2在肝外膽管癌中的表達情況與腫瘤臨床病理學特征的相關性;對比淋巴結轉移灶和肝轉移灶與原發(fā)灶組織中l(wèi)amininγ2表達的差異。
　　3、隨訪72例肝外膽管癌病人的死亡時間和/或腫瘤復發(fā)時間，根據(jù)

6、手術日期計算出病人術后總生存時間和無瘤存活時間。分別使用Kaplan-Meier和Cox模型，分析肝外膽管癌中l(wèi)amininγ2表達與病人預后的關系。
　　4、應用RNA干擾技術下調肝外膽管癌細胞(QBC939)lamininγ2表達，采用Transwell細胞侵襲實驗和細胞劃痕實驗觀察下調lamininγ2對肝外膽管癌細胞侵襲和遷移能力的影響。
　　四、結果:
　　1、Lamininγ2在肝外膽管癌中存在兩種表達類型

7、:腫瘤細胞胞漿表達和/或腫瘤細胞外基質表達;72例肝外膽管癌組織中，28例腫瘤細胞外基質染色陽性，24例腫瘤細胞胞漿染色陽性，16例既有腫瘤細胞胞漿染色陽性又有腫瘤細胞外基質染色陽性;16例癌旁、5例肝外膽管腺瘤及8例炎性膽管上皮細胞lamininγ2染色均為陰性。將lamininγ2表達分為腫瘤細胞外基質表達組和腫瘤細胞胞漿表達組，分別與腫瘤的臨床病理學參數(shù)行相關性分析提示:腫瘤細胞外基質lamininγ2表達與淋巴結轉移顯著相關(p

8、=0.01);腫瘤細胞胞漿lamininγ2表達與淋巴結轉移和遠處器官轉移顯著相關(p=0.02;p=0.01);28例淋巴結轉移灶組織中，17例lamininγ2腫瘤細胞胞漿染色陽性，高于其在原發(fā)灶胞漿表達水平(P=0.01);7例肝轉移灶組織中，4例lamininγ2腫瘤細胞胞漿染色陽性，高于其在原發(fā)灶胞漿表達水平。上述結果提示:肝外膽管癌中l(wèi)amininγ2異常表達與腫瘤的侵襲轉移相關。
　　2、Kaplan-Meier模型

9、生存分析提示:肝外膽管癌細胞外基質或胞漿lamininγ2表達陽性病人的術后總生存時間顯著低于lamininγ2表達陰性的病人(log-rankp=0.007;p=0.008),肝外膽管癌細胞外基質或胞漿lamininγ2表達陽性病人的術后腫瘤復發(fā)時間顯著早于lamininγ2表達陰性的病人(log-rankP=0.004;P=0.006)。然后我們將lamininγ2表達情況進行分組:細胞外基質和胞漿均陽性組;細胞外基質陽性、胞漿陰性

10、組;胞外基質陰性、胞漿陽性組;細胞外基質和胞漿均陰性組。分析提示無論肝外膽管癌lamininγ2是哪種類型表達陽性，其病人術后總生存時間均顯著低于lamininγ2表達陰性的病人(log-rankP=0.001);無論肝外膽管癌lamininγ2是哪種類型表達陽性，其病人術后腫瘤復發(fā)時間均顯著早于lamininγ2表達陰性的病人(log-rankp＜0.001)。Cox模型分析提示lamininγ2表達是判斷肝外膽管癌術后病人存活時間和

11、腫瘤復發(fā)相對獨立危險因素(HR=2.465,95％CI=1.391-4.368,p=0.002;HR=2.679,95％CI=1.547-4.638,p＜0.001)。上述結果提示:肝外膽管癌lamininγ2異常表達可能是判斷病人預后的分子標志。
　　3、體外實驗中采用免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)，lamininγ2表達在QBC939細胞胞漿。在QBC939細胞中，干擾lamininγ2的表達顯著抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。結果提示:l