c-myc反義寡核苷酸對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及P27表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)是人類皮膚受損、創(chuàng)面愈合后瘢痕持續(xù)增生的一種病理現(xiàn)象，它的病理本質(zhì)是以成纖維細(xì)胞(Fibroblast，F(xiàn)b)為主的細(xì)胞成分的過(guò)度增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracel 1ular matrix，ECM)的過(guò)度沉積，目前其發(fā)病機(jī)制還不清楚。瘢痕增生過(guò)度攣縮，常常導(dǎo)致各種畸形功能障礙，給患者帶來(lái)身心痛苦。多年來(lái)，瘢痕增生一直無(wú)確切的治療方法。基因治療是分子生物學(xué)的主要

2、應(yīng)用領(lǐng)域之一，理論上可以從根本上阻止許多疾病的發(fā)生與進(jìn)展，并有望達(dá)到治愈的目的，但如何選擇靶基因及靶細(xì)胞成為其關(guān)鍵?！　－myc是細(xì)胞原癌基因，其編碼的62KD核蛋白通過(guò)與核蛋白Max形成二聚體結(jié)合特異的DNA序列(CAcTGT)激活許多靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中很多基因產(chǎn)物與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。c－myc屬于永生性癌基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、凋亡及分化中具有非常重要的地位。c-myc的過(guò)度表達(dá)是人類腫瘤細(xì)胞最常見(jiàn)的變化之一。近年來(lái)國(guó)外研

3、究表明c-myc與增生性瘢痕關(guān)系密切。國(guó)外學(xué)者以c－myc反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASODN)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，分別采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting檢測(cè)的結(jié)果均顯示，腫瘤細(xì)胞c-Myc蛋白水平顯著降低。增生性瘢痕形成的早期階段，通過(guò)基因進(jìn)行干預(yù)，是防止瘢痕增生和攣縮的較佳時(shí)機(jī)。但目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)到c-mVc ASODN對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞c-myc mRNA表達(dá)影響的報(bào)道。國(guó)

4、內(nèi)尚未見(jiàn)到c-myc ASODN處理增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的類似報(bào)道。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p27對(duì)許多腫瘤有抑制作用，因此p27又被稱為抑癌基因，是腫瘤抑制性治療的重要候選者，但其在瘢痕增生過(guò)程中的作用尚不清楚。p27蛋白的表達(dá)在增生性瘢痕中比正常皮膚組織低，提示p27司能與瘢痕形成有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞高表達(dá)c-myc可直接引起p27下調(diào)，　　從而出現(xiàn)細(xì)胞增殖。c-myc ASODN作用于成纖維細(xì)胞后能否增強(qiáng)p27的

5、表達(dá)，至今國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。　　目的：觀察c-myc ASODN對(duì)體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、c-myc和P27 mRNA的表達(dá)及其蛋白水平的影響，為探討c-myc ASODN在治療增生性瘢痕中的機(jī)制以及進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?！　》椒ǎ撼Ｒ?guī)進(jìn)行細(xì)胞的消化法原代培養(yǎng)，取第3代培養(yǎng)細(xì)胞繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)、形態(tài)及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。設(shè)計(jì)、合成c-myc ASODN，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的增

6、生性瘢痕成纖維細(xì)胞。設(shè)空白組和SODN組為對(duì)照，鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)變化；采用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度(10μmol／L，20μmol／L，30μnol／L和40μmol／L)的c-myc ASODN作用72h以及在不同時(shí)間點(diǎn)(12h，24h，48h，72h和96h)30μmol／L c-myc ASODN對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)c-myc ASODN對(duì)成纖維細(xì)胞周期的影響；用<'3>H-TdR及<'3>H-

7、脯氨酸摻入法測(cè)定c-myc ASODN干預(yù)下成纖維細(xì)胞DNA及膠原合成作用的變化；分別用RT-PCR和Western Blotting的方法檢測(cè)c-myC ASODN對(duì)成纖維細(xì)胞c-myc及P27 mRNA表達(dá)及其蛋白水平的變化?！　〗Y(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞從形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定證實(shí)為增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。①ASODN組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，排列稀疏，但細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯不同之處。②轉(zhuǎn)染72h后，10μmol／L，20μmol／L，30

8、μmol／L和40μmol／L ASODN組的成纖維細(xì)胞的增殖均受到不同程度抑制，除10pmol／L ASODN組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，其余三組(20μmol／L，30μmol／L和40μmol／L ASODN組)與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05或<0.01)。30μmol／L ASODN組與10μmol／L，20μmol／L ASODN組相比有顯著差異(P均<0.05)，而與40μmol／L ASODN組

9、相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。30μmol／L ASODN作用12h，24h，48h，72h和96h后，成纖維細(xì)胞均受到不同程度的抑制，各時(shí)點(diǎn)對(duì)照組與其相應(yīng)ASODN組相比顯示，除12h時(shí)兩組無(wú)顯著性差異外 (P>0.05)，其余各時(shí)點(diǎn)比較均有顯著性差異(P>0.05或<0.01)；ASODN對(duì)成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在12～72h間，隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大，72h達(dá)高峰，96h 時(shí)出現(xiàn)下落。30μmol／L c-myc ASODN可顯

10、著抑制成纖維細(xì)胞DNA合成，SODN無(wú)明顯抑制作用。c-myc ASODN使成纖維細(xì)胞增殖指數(shù)降低，G1期比例增大，細(xì)胞阻滯于G1期，GI／S轉(zhuǎn)換受到抑制。③c-myc ASODN在20μmol／L，30μmol／L，40μmol／L的藥物濃度時(shí)即可顯著抑制其膠原合成。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，c-myc ASODN可使成纖維細(xì)胞I型膠原蛋白水平明顯降低。④RT-PCR結(jié)果顯示，c-myc SODN 30μmol／L濃度組c-myc mRN

11、A表達(dá)無(wú)明顯變化，是Control組的(0．98±0．30)倍(P>O．05)，差異無(wú)顯著性。c-myc ASODN 10μmol／L，20μmol／L，30μmol／L和40μmol／L濃度組c-myc表達(dá)均有不同程度的降低，c-myc表達(dá)量分別是Control組的(0．79±0．14)、(0．41±0．17)、(0．34±0．11)和(0．37±0．15)倍，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，具有顯著性差異(P

12、tern Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，c-myc SODN 30Pmol／L濃度組c-myc表達(dá)無(wú)明顯變化，為Control組的(0．99±0．29)倍(P>O．05)，差異無(wú)顯著性。c-myc ASODN 10μmol／L，20μmol／L，30μmol／L和40μmol／L濃度組c-myc表達(dá)均有不同程度的降低，c-myc表達(dá)量分別是Control組的(0．77±0．16)、(0．60±0．25)、(0．38±0．10)和(0．4

13、2±0．13)倍，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，具有顯著性差異(P(0．05或P(0．01)。⑤RT-PCR結(jié)果顯示，c-myc ASODN30Pmol／L濃度組p27mRNA表達(dá)升高，p27表達(dá)量是Control組的(1．89±O．34)倍，與對(duì)照組比較，具有顯著性差異(PO．05)。West

14、ern Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，c-myc ASODN 30μnol／L濃度組p27蛋白水平升高，p27表達(dá)量是Control組的(2．07±0．42)倍，與對(duì)照組比較，差異非常顯著(P<0．01)。c-myc SODN 30μnol／L濃度組p27蛋白水平無(wú)明顯變化，是Control組的(1．08±O．27)倍(P>0．05)，差異無(wú)顯著性?！　〗Y(jié)論：(Dc-myc ASODN對(duì)體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞具有增殖抑制作用

15、，且這種作用具有序列特異性，并呈濃度和時(shí)間依賴性；c-myc ASODN轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的最佳濃度為30μnol／L，有效作用時(shí)間為24h，48h和72h。c-myc ASODN可抑制成纖維細(xì)胞DNA的合成，并能使成纖維細(xì)胞G1期比例增大，GI／S轉(zhuǎn)換受抑，使細(xì)胞阻滯于G1期。②c-myc ASODN可抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原的合成，并能使成纖維細(xì)胞I型膠原蛋白水平明顯降低。 ③c-myc ASODN具有下調(diào)成纖維細(xì)胞c-m