CD147-EMMPRIN與轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中破骨細(xì)胞活化機(jī)制的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 骨組織是腫瘤晚期常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，諸多惡性腫瘤晚期均易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，其發(fā)生率要明顯高于骨原發(fā)惡性腫瘤，其原發(fā)灶多來(lái)自前列腺癌、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤的晚期。腫瘤骨轉(zhuǎn)移后多以溶骨性骨破壞為主，為患者帶來(lái)骨質(zhì)疏松、病理性骨折、進(jìn)行性骨痛、高鈣血癥、脊髓壓迫綜合征等并發(fā)癥，顯著降低患者的5年生存率，嚴(yán)重影響患者的健康及生活質(zhì)量。
　　 腫瘤骨轉(zhuǎn)移是由腫瘤-骨微環(huán)境中，一系列細(xì)胞因子所參與的惡性循環(huán)過(guò)程，包括

2、腫瘤細(xì)胞、骨細(xì)胞及基質(zhì)之間的相互作用，從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)及骨質(zhì)破壞。破骨細(xì)胞(osteoclasts，OCs)作為骨破壞吸收的關(guān)鍵細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)多種途徑及多種因素來(lái)促進(jìn)其形成及異常活化來(lái)介導(dǎo)溶骨性骨破壞的發(fā)生，因此OCs作為研究及防治腫瘤骨破壞的關(guān)鍵點(diǎn)，我們將予以深入研究。
　　 CD147又名細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteaseinducer，EMMPRIN

3、)與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)CD147能夠誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞活化，并通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的產(chǎn)生，參與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨、骨組織的降解破壞過(guò)程及牙周炎牙槽骨破壞過(guò)程。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制CD147在乳腺癌細(xì)胞的過(guò)表達(dá)時(shí)，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移及骨破壞進(jìn)程均得到有效延緩。因此我們相信在腫瘤骨轉(zhuǎn)移及骨破壞過(guò)程中，可能有CD147直接或間接的參與，且經(jīng)本實(shí)驗(yàn)

4、組前期體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)CD147可高表達(dá)于OCs表面，并參與OCs的生成及活性調(diào)節(jié)。鑒于CD147發(fā)揮多種生物學(xué)活性均與其介導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生密切相關(guān)，而MMPs又是OC活化過(guò)程中一種重要的調(diào)節(jié)因子，由此我們推測(cè)在腫瘤轉(zhuǎn)移后的溶骨性破壞過(guò)程中存在著腫瘤細(xì)胞通過(guò)CD147激活OCs介導(dǎo)骨破壞的發(fā)生，其調(diào)節(jié)機(jī)制可能與MMPs的產(chǎn)生相關(guān)。
　　 因此本研究通過(guò)體外建立外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononucle

5、ar cells，PBMCs)向OCs分化成熟的模型，研究CD147與OCs分化過(guò)程中MMPs合成、分泌及活性調(diào)節(jié)的相關(guān)性，探討CD147對(duì)OCs活化調(diào)節(jié)的機(jī)制和方式；通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)移性骨腫瘤。
　　 臨床標(biāo)本中CD147的表達(dá)情況，及CD147與腫瘤骨破壞過(guò)程中OCs活化的關(guān)系，初步驗(yàn)證前期體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，從而完善對(duì)CD147參與腫瘤骨破壞過(guò)程的認(rèn)識(shí)，并為本課題組的下一步深入研究提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)參考和理論依據(jù)。
　　 方法：<

6、br>　　 1.Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁法純化所分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞；
　　 2.引入外源性巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)蛋白和細(xì)胞核因子κB受體活化因子配基(receptor or activator ofNF-KB ligand，RANKL)蛋白誘導(dǎo)PBMCs向OCs分化，利用TRAP染色和骨吸收實(shí)驗(yàn)觀察及鑒定誘導(dǎo)生

7、成的細(xì)胞，并檢測(cè)其骨吸收功能；
　　 3.實(shí)驗(yàn)分別分為第一部分兩組[對(duì)照組(正常誘導(dǎo)組)和蛋白組]和第二部分兩組[對(duì)照組(正常誘導(dǎo)組)和抗體組]；
　　 4.對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)第12天的細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及抗酒石酸的酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色鑒定，對(duì)與細(xì)胞共培養(yǎng)第30天的骨薄片，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察骨薄片表面骨吸收陷窩情況；
　　 5.Real-

8、time PCR檢測(cè)24h與48h時(shí)相點(diǎn)上OCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中CD147 mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)mRNA及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)mRNA的表達(dá)情況，及分析三者的相關(guān)性；
　　 6.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)24h與48h時(shí)相點(diǎn)上OCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的表達(dá)

9、情況；
　　 7.明膠酶譜法檢測(cè)OCs在24h與48h分泌的MMP-2、MMP-9酶蛋白活性變化情況；
　　 8.免疫組化SP法檢測(cè)轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)情況；
　　 9.RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147 mRNA、MMP-2 mRNA及MMP-9 mRNA的表達(dá)情況；
　　 10.蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色及TRAP染

10、色觀察及鑒定轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs的情況；
　　 11.免疫組化SP法初步檢測(cè)CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs內(nèi)的表達(dá)情況；
　　 12.采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用Ficoll密度梯度離心法，分離外周靜脈血獲得單個(gè)核細(xì)胞，并通過(guò)延長(zhǎng)貼壁時(shí)間純化細(xì)胞的方法，可以獲得數(shù)量較多、純度較好的單個(gè)核細(xì)胞，能夠滿足體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需求

11、；
　　 2.引入外源性RANKL蛋白和M-CSF蛋白能夠誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞生成TRAP染色陽(yáng)性的單核或多核細(xì)胞，并具有骨吸收能力；
　　 3.TRAP染色結(jié)果示：蛋白組第12天TRAP(+)細(xì)胞數(shù)及體積顯著高于對(duì)照組，且生成體積巨大的多核破骨細(xì)胞；抗體組第12天TRAP(+)細(xì)胞數(shù)及體積顯著低于對(duì)照組，且未見(jiàn)多核破骨細(xì)胞形成。骨吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：蛋白組及對(duì)照組均形成明顯的骨吸收陷凹；蛋白組形成大片狀骨吸收陷窩，面積顯著

12、大于對(duì)照組；抗體組卻未見(jiàn)骨吸收陷凹形成；
　　 4.Real-time PCR結(jié)果顯示：24、48 h時(shí)相點(diǎn)上蛋白組細(xì)胞CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；24h、48 h時(shí)相點(diǎn)上抗體組細(xì)胞CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；兩次實(shí)驗(yàn)中MMP-2、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與CD147 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均呈正相關(guān)關(guān)系

13、[(R=0.818和R=0.758，P<0.05)，(R=0.525和R=0.552，P<0.05)]；
　　 5.ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：在24h與48 h時(shí)相點(diǎn)上蛋白組細(xì)胞MMP-2及MMP-9酶蛋白的分泌量均顯著高于相應(yīng)的對(duì)照組(P<0.05)；
　　 6.明膠酶譜法檢測(cè)結(jié)果顯示(酶蛋白活性以條帶酶解量代表)：抗體組MMP-2、MMP-9酶原及活性酶條帶的酶解量與對(duì)照組間比較具有顯著差異(P<0.05)，且在24h

14、、48h時(shí)相點(diǎn)上抗體組MMP-2、MMP-9酶原及活性酶條帶的酶解量均顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組(P<0.05)；
　　 7.免疫組化SP法檢測(cè)轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果示：CD147、MMP-2、MMP-9蛋白在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中高表達(dá)，且顯著高于良性骨腫瘤中的表達(dá)(P<0.05)；
　　 8.RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果示：

15、轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于良性骨腫瘤(P<0.05)，且MMP-2、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與CD147 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均成正相關(guān)關(guān)系(R=0.795和R=0.956，P<0.05)；
　　 9.HE染色及TRAP染色觀察及鑒定轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs的形態(tài)，結(jié)果示：轉(zhuǎn)移性骨腫瘤組織標(biāo)本中可見(jiàn)到多個(gè)多核巨細(xì)胞，分布于腫瘤組織與骨組織交界面的位置，經(jīng)TRAP染色鑒

16、定該多核巨細(xì)胞為T(mén)RAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞；
　　 10.免疫組化SP法初步檢測(cè)CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果示：CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本內(nèi)的破骨細(xì)胞胞漿及胞膜中，均呈現(xiàn)棕黃色的陽(yáng)性反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.使用外源性M-CSF蛋白及RANKL蛋白共同誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的方法，能夠誘導(dǎo)生成TRAP染色陽(yáng)性，具有骨吸收能力的破骨細(xì)胞，此模型建立方法較為可靠，可以滿足

17、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的要求；
　　 2.外源性CD147蛋白增強(qiáng)破骨前體細(xì)胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水平的表達(dá)，且能夠促進(jìn)體外OCs分化過(guò)程中MMP-2、MMP-9蛋白的分泌，提示外源性CD147可能與破骨細(xì)胞分化過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶的合成及分泌相關(guān)；
　　 3.CD147單克隆抗體(CD147 monoclonal antibodies，CD147mAb)能降低破骨前體細(xì)胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水

18、平的表達(dá)，且能夠降低體外OCs分化過(guò)程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的活性，提示內(nèi)源性CD147可能與破骨細(xì)胞分化過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)及活性調(diào)節(jié)相關(guān)；
　　 4.CD147、MMP-2及MMP-9在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中高表達(dá)，且CD147與MMP-2、MMP-9的表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，提示三者可能與腫瘤骨轉(zhuǎn)移及骨破壞過(guò)程密切相關(guān)；
　　 5.CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中破骨細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，初步提示CD147可能與轉(zhuǎn)移性骨腫瘤骨