內(nèi)耳ENaC和AQPs的表達(dá)及醛固酮對(duì)ENaC的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、膜迷路內(nèi)淋巴為高鉀低鈉的溶液，其離子濃度與細(xì)胞內(nèi)液相似，而外淋巴則為低鉀高鈉的溶液。內(nèi)、外淋巴的液體成分保持動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)于維持內(nèi)耳的正常功能具有重要的意義。如果內(nèi)、外淋巴離子失衡，可能造成內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境紊亂，從而引發(fā)某些內(nèi)耳疾病，如膜迷路積水，即為內(nèi)淋巴的分泌過多/吸收障礙所致，也是梅尼埃病(MD)的重要發(fā)病原因。目前對(duì)內(nèi)淋巴K+轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究較多，而對(duì)Na+和H2O的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制卻知之甚少。 對(duì)腎、肺、腦等組織的研究表明，上皮鈉通道(

2、ENaC)是調(diào)節(jié)上皮Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的限速分子，且ENaC的表達(dá)受SGK1和Nedd4的調(diào)節(jié)，而水通道蛋白(Aquaporin，AQP)則是調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞H2O轉(zhuǎn)運(yùn)的重要分子。為探討ENaC和AQP分子在內(nèi)耳的表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)按如下三部分進(jìn)行研究。第一部分采用免疫組化法，以特異性多克隆抗體定位觀察大鼠和豚鼠內(nèi)耳組織中ENaC、SGK1和Nedd4異構(gòu)體蛋白分子的表達(dá)，并用αENaC和SGK1的cDNA質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄合成cDNA探針，以原位

3、雜交的方法觀察內(nèi)耳組織中αENaC和SGK1基因mRNA的表達(dá)分布。第二部分以雙側(cè)腎上腺切除大鼠為模型，觀察該模型動(dòng)物的聽功能變化、血管紋超微結(jié)構(gòu)變化，并用Westernblot和RT-PCR方法觀察醛固酮對(duì)αENaC和SGK1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，了解醛固酮與ENaC調(diào)節(jié)和內(nèi)耳功能形態(tài)學(xué)問的關(guān)系。第三部分用免疫組織化學(xué)法觀察內(nèi)耳組織中AQP1～4亞型分子的表達(dá)，為進(jìn)一步研究其在內(nèi)淋巴調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下：1.在

4、豚鼠內(nèi)耳組織中，ENaC的α、β、γ亞基蛋白和SGK1蛋白表達(dá)于除血管紋外的耳蝸組織中，但αENaC在螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)呈陰性，而Nedd4異構(gòu)體則表達(dá)于包括血管紋的耳蝸各個(gè)區(qū)域中。在內(nèi)淋巴囊上皮細(xì)胞和上皮下組織中，ENaC、SGK1、Nedd4都呈陽性表達(dá)。αENaCmRNA和SGK1mRNA表達(dá)于耳蝸血管紋、螺旋緣、螺旋韌帶下端及內(nèi)淋巴囊中。 2.在大鼠內(nèi)耳組織中，ENaC的α、β、γ亞基蛋白和SGK1、Nedd4-1/2異構(gòu)

5、體蛋白廣泛分布于耳蝸組織中。αENaCmRNA與其蛋白表達(dá)模式相近，而SGK1mRNA則表達(dá)于除螺旋神經(jīng)節(jié)和Reissner膜外的耳蝸組織中。 3.與正常大鼠相比，雙側(cè)腎上腺切除大鼠的聽功能、血管紋超微結(jié)構(gòu)無明顯變化。 4.RT-PCR分析顯示，與正常大鼠相比，ADX大鼠的內(nèi)耳αENaCmRNA表達(dá)顯著下降，而ADX+ALD大鼠則明顯恢復(fù)。 5.Westernblot分析顯示，與正常大鼠相比，ADX大鼠的內(nèi)耳SG

6、K1蛋白表達(dá)顯著下降，而ADX+ALD大鼠則明顯恢復(fù)至近正常水平。 6.在大鼠和豚鼠耳蝸組織中，AQP1、3、4廣泛表達(dá)于各個(gè)亞結(jié)構(gòu)中，而AQP2則僅表達(dá)于Reissner膜。在豚鼠內(nèi)淋巴囊中，除AQP2的表達(dá)呈陰性外，AQP1、3、4在上皮細(xì)胞和上皮下組織中都呈陽性表達(dá)。 綜合以上研究結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：1.ENaC、SGK1、Nedd4分子以不同模式表達(dá)于不同種屬動(dòng)物內(nèi)耳的各個(gè)部位，提示這些分子可能形成調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴