豬β-防御素基因表達(dá)特點(diǎn)及維生素A的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、防御素是抗菌肽家族成員之一，具有廣泛的抗菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)和免疫調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。維生素A作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)動(dòng)物的抗感染能力、細(xì)胞因子以及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響十分明顯。然而，關(guān)于豬防御素基因表達(dá)規(guī)律及維生素A對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié)作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在考察豬防御素基因表達(dá)的品種和組織差異及維生素A對(duì)其表達(dá)的影響，以揭示豬防御素基因的表達(dá)特點(diǎn)和維生素A的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)首先考察了不同抗病力的兩種豬體內(nèi)防御素-

2、1、2、3基因表達(dá)的差異，并通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)比較了不同維生素對(duì)防御素-1、2、3基因表達(dá)的影響，重點(diǎn)研究了在動(dòng)物試驗(yàn)中維生素A對(duì)豬防御素-1、2、3基因表達(dá)的影響，初步探討了維生素A影響豬防御素-1、2、3基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本研究包括以下四個(gè)試驗(yàn)：
　　 試驗(yàn)一DLY和梅山仔豬pBD基因表達(dá)差異的研究
　　 通過(guò)觀察防御素基因在DLY和梅山仔豬各個(gè)組織中的表達(dá)水平，比較了兩個(gè)豬種之間的表達(dá)差異。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇健

3、康的7日齡梅山豬和DLY（杜×長(zhǎng)×大）雜交豬各6頭，公母各半。屠宰后立即取其小腸黏膜、心、肝、脾、肺、腎、腦、皮膚、肌肉、口腔黏膜、呼吸道上皮、舌頭、胸腺、生殖道上皮、睪丸（公）或卵巢（母），提取總RNA，用Real-timePCR方法檢測(cè)pBD-1、2、3基因mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果表明：所有組織中均能檢測(cè)出pBD基因mRNA的表達(dá)。其中梅山豬中，pBD-1、2、3在舌頭和口腔黏膜的表達(dá)量最高；而DLY雜交豬中，pBD-

4、1、3在舌頭和口腔黏膜的表達(dá)量最高，pBD-2在腎臟和肝臟的表達(dá)量最高。絕大部分組織的pBD基因表達(dá)量均為梅山豬高于DLY雜交豬，其中小腸黏膜、舌、口腔黏膜和生殖道黏膜等與外界接觸的組織中的pBD-1、2、3表達(dá)量均是以梅山豬為高。由此顯示，豬pBD的表達(dá)存在明顯的品種差異和組織特異性，梅山豬體內(nèi)pBD-1、2、3基因在多個(gè)組織中的表達(dá)量要高于DLY三元雜交豬。
　　 試驗(yàn)二VA、VD、VE對(duì)IPEC-J2細(xì)胞系pBD基因mRN

5、A和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
　　 為了考察VA、VD、VE對(duì)pBD-1、2、3基因mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)選用豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2為研究對(duì)象，在無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基上分別添加不同濃度的維生素A、D、E培養(yǎng)，24小時(shí)后，提取總RNA和蛋白。用Real-timePCR法測(cè)定pBD-1、2、3基因mRNA表達(dá)水平，用ELISA方法測(cè)定pBD-1、2、3蛋白含量。分析不同濃度維生素對(duì)pBD基因與蛋白表達(dá)的影響。

6、r>　　 結(jié)果表明：維生素A、D、E均能夠不同程度的誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞pBD基因的表達(dá)并能促進(jìn)pBD蛋白的分泌。其中，0.5～20μmol/L維生素A可顯著提高pBD-1、pBD-2和/或pBD-3基因的mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平；5～50nmol/L維生素D顯著提高了pBD-1、pBD-2或pBD-3基因的mRNA表達(dá)水平或蛋白質(zhì)表達(dá)水平；20和50μg/ml維生素E顯著提高了pBD-1和pBD-3基因的mRNA表達(dá)水平或蛋白

7、質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果提示，在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，維生素A、D、E可以促進(jìn)pBD-1、2、3基因mRNA與蛋白的表達(dá)，其中維生素A對(duì)pBD-1、2、3基因表達(dá)的促進(jìn)作用效果較好。
　　 試驗(yàn)三VA對(duì)DLY和榮昌仔豬pBD基因表達(dá)的影響
　　 為了考察動(dòng)物試驗(yàn)中維生素A對(duì)內(nèi)源防御素表達(dá)的影響，本試驗(yàn)選用產(chǎn)期相近、胎次相似、相同環(huán)境飼養(yǎng)健康的21日齡斷奶、體重約3.5-4kg榮昌豬斷奶仔豬24頭，按體重隨機(jī)分為4組，1、3組飼喂維生

8、素A缺乏日糧，2、4組飼喂正常水平維生素A日糧。另外選擇產(chǎn)期相近、胎次相似、相同環(huán)境飼養(yǎng)健康的21日齡斷奶、體重6.5-7kgDLY斷奶仔豬30頭，按體重隨機(jī)分為5組，5、7組飼喂維生素A缺乏日糧，6、8組飼喂正常水平維生素A日糧，9組飼喂高劑量維生素A（5倍NRC水平）日糧。每個(gè)處理組設(shè)有6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，試驗(yàn)期包括預(yù)飼兩周和正式試驗(yàn)四周，在正式試驗(yàn)第14天對(duì)3、4、7、8和9組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種PRRS弱毒苗。進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)和屠宰試

9、驗(yàn)。
　　 結(jié)果表明：
　　 1.DLY豬的日增重和日采食量均顯著高于榮昌豬；攻毒（接種PRRS弱毒苗）顯著降低了兩種豬的日增重和日采食量，顯著升高了其料重比；攻毒對(duì)DLY豬生產(chǎn)性能的影響強(qiáng)于榮昌豬；
　　 2.DLY豬體內(nèi)血清視黃醇濃度和肝臟視黃醇濃度均顯著高于榮昌豬；攻毒可降低豬血清視黃醇濃度，顯著提高肝臟視黃醇濃度：維生素A缺乏顯著降低了血清視黃醇濃度和肝臟視黃醇濃度；高劑量維生素A顯著升高了肝臟視黃醇濃度

10、，升高血清視黃醇濃度；
　　 3.攻毒顯著提高了豬血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的濃度；維生素A缺乏顯著降低了豬血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的濃度；攻毒對(duì)DLY豬血清中IgA和IgG的影響強(qiáng)于榮昌豬；
　　 4.攻毒顯著提高細(xì)胞因子IL-1a、IL-1β、IL-10的濃度；維生素A水平缺乏顯著
　　 提高了細(xì)胞因子IL-1a、IL-1β的濃度，降低了細(xì)胞因子IL-10的濃度；
　　 5.

11、接種PRRS弱毒苗對(duì)pBD-1、3基因表達(dá)的影響不大，能顯著提高pBD-2在肺、脾、腸系膜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)中的表達(dá)；日糧中維生素A水平對(duì)pBD-2基因表達(dá)的影響不大，能顯著影響pBD-1、3在舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜和小腸黏膜中的表達(dá)。
　　 結(jié)果顯示，攻毒降低了試驗(yàn)動(dòng)物日采食量、日增重和血清維生素A，提高了豬血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的濃度，提高了pBD-2基因在肺、脾、腸系膜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)中的表達(dá)，相比

12、較而言，攻毒對(duì)DLY豬的影響要強(qiáng)于榮昌豬；維生素A缺乏降低了血清視黃醇的含量與體內(nèi)部分組織中pBD-1、3基因的表達(dá)，攻毒可以加劇這種作用。
　　 試驗(yàn)四VA影響pBD基因表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究
　　 為初步揭示維生素A誘導(dǎo)pBD-1、2、3基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，本試驗(yàn)以IPEC-J2細(xì)胞系為研究模型，考察信號(hào)通路阻斷劑對(duì)維生素A誘導(dǎo)pBD-1、2、3基因mRNA表達(dá)的影響。試驗(yàn)選用的信號(hào)通路阻斷劑有NF-κB通路阻斷

13、劑MG-132和MEK-ERK通路阻斷劑PD98059，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共分對(duì)照組、維生素A組、MG-132組、PD98059組、維生素A+MG-132組和維生素A+PD98059組6個(gè)處理組。
　　 結(jié)果表明，MG-132極顯著的降低了維生素A對(duì)pBD-2基因的誘導(dǎo)作用，PD98059極顯著的降低了維生素A對(duì)pBD-1和pBD-3基因的誘導(dǎo)作用。結(jié)果提示，NF-κB通路可能是維生素A影響pBD-2基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一

14、；MEK-ERK通路可能是維生素A影響pBD-1、3基因的表達(dá)的信號(hào)通路之一。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明：
　　 1.抗病力不同的梅山豬和DLY豬體內(nèi)pBD的表達(dá)水平也不相同，抗病力較高的地方豬種--梅山豬具有較高的防御素表達(dá)量。
　　 2.維生素A、D、E均能夠誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞pBD-1、2、3基因的表達(dá)，并能促進(jìn)其蛋白質(zhì)的分泌。其中，維生素A對(duì)pBD-1、2、3基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用最為顯著。