醛固酮降低心衰大鼠減壓神經(jīng)ENaC的機(jī)制研究.pdf

1、減壓反射對心血管活動(dòng)起重要的調(diào)節(jié)作用。心力衰竭(Heart Failure，HF)患者和HF動(dòng)物模型的減壓反射敏感性明顯降低，擾亂自主神經(jīng)平衡，導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性增加，而副交感神經(jīng)活動(dòng)下降，從而使發(fā)病率和死亡率均增加。研究HF降低減壓反射的機(jī)制對預(yù)防HF引起的猝死有重要的臨床意義。有文獻(xiàn)報(bào)道減壓反射的傳入神經(jīng)敏感性和興奮性降低導(dǎo)致了減壓反射敏感性降低，但傳入神經(jīng)對血壓變化敏感性降低的機(jī)制目前仍不清楚。
　　位于減壓神經(jīng)末梢的機(jī)械敏

2、感性離子通道epithelial sodium channel(ENaC)感受主動(dòng)脈弓處血管擴(kuò)張，引起減壓神經(jīng)興奮，從而傳遞血壓變化的信息。ENaC水平受泛素連接酶Nedd4-2的負(fù)調(diào)控。以往的研究發(fā)現(xiàn)，升高體內(nèi)醛固酮水平可降低減壓神經(jīng)中ENaC通道的表達(dá)，同時(shí)降低減壓反射的敏感性。而HF患者和HF動(dòng)物模型都表現(xiàn)出醛固酮水平升高，減壓反射功能降低。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制作HF大鼠模型，觀察

3、其醛固酮水平和減壓反射敏感性的變化，檢測結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中ENaC、p-ERK1/2表達(dá)的變化，以及Nedd4-2與ENaC結(jié)合的變化，探討HF降低ENaC的機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法，制作HF大鼠模型。模型制備6-8周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:①正常對照組(Ctrl，n=6)②假手術(shù)組(sham，n=6)③心衰組(HF，n=6)④心衰加螺內(nèi)酯組(HF+SPI，n=6

4、)。
　　3.血壓和心率的測量:麻醉后，股動(dòng)脈插管技術(shù)測量血壓和心率。
　　4.動(dòng)脈壓力反射敏感性的測量:靜脈注射硝普鈉(SNP)和苯腎上腺素(PE)分別誘導(dǎo)升壓反射和降壓反射，將反射前后收縮壓變化值與心動(dòng)周期變化值之比(ΔSBP/ΔCC)作為升壓反射敏感性(BRS-SNP)和降壓反射敏感性(BRS-PE)的指標(biāo)。
　　5.測量血漿醛固酮濃度:取新鮮的大鼠動(dòng)脈血，用大鼠醛固酮試劑盒測定大鼠血漿中醛固酮的濃度。
　

5、　6.采用HE染色、天狼猩紅染色和Masson三色染色技術(shù)檢測大鼠心臟的組織學(xué)變化。
　　7.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)狀神經(jīng)節(jié)(nodose ganglion，NG)中ENaC-β、ENaC-γ、p-ERK1/2的表達(dá)，并使用Co-IP技術(shù)檢測Nedd4-2與ENaC結(jié)合的變化。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SEM)表示，使用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析或雙因素方

6、差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠心臟組織病理學(xué)檢查表明，常規(guī)HE染色可見冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后大鼠左心室前壁心肌梗死部位室壁變薄，心肌組織疏松，心肌細(xì)胞核消失以及大量炎癥細(xì)胞浸潤。天狼猩紅和Masson三色染色進(jìn)一步證實(shí)心肌梗死部位的成纖維化。
　　2.模型制造8周后，測得大鼠體內(nèi)的醛固酮濃度Ctrl組為362.4±26.01pg/ml，sham組為358.8±29.17pg/ml，H

7、F組為626.2±52.47pg/ml，HF+SPI組為600.7±47.88pg/ml。HF組和HF+SPI組醛固酮濃度明顯高于Ctrl組(P＜0.005)。
　　3.模型制備成功后，大鼠的減壓反射敏感性(BRS)分別為:Ctrl組為1.095±0.025ms/mmHg，sham組為1.065±0.008ms/mmHg，HF組為0.405±0.013ms/mmHg，HF+SPI組為0.593±0.037ms/mmHg。HF組和H

8、F+SPI組BRS明顯低于Ctrl組和sham組(P＜0.0001)，而醛固酮受體阻斷劑SPI可以減弱HF對BRS的影響，使之顯著升高(P＜0.001)，但是不能使之恢復(fù)至正常水平。
　　4.通過Western Blotting檢測ENaC-β和ENaC-γ蛋白表達(dá)，計(jì)算條帶灰度相對值，結(jié)果為:Ctrl組的NG中ENaC-β和ENaC-γ，分別為1.207±0.217和0.6922±0.0363，sham組分別為1.329±0.1

9、65和0.7659±0.0352，兩組間無顯著差異(P＞0.05);HF組分別為0.3309±0.121和0.2822±0.025，比Ctrl組明顯減少(P＜0.05);而HF+SPI組分別為0.736±0.0424和0.3848±0.008，也比Ctrl組ENaC表達(dá)減少。表明HF導(dǎo)致ENaC表達(dá)量降低。HF+SPI組與HF組相比ENaC蛋白表達(dá)量升高(P＜0.05)，說明SPI能改善HF引起的ENaC變化，但是不能使其恢復(fù)至正常。<

10、br>　　5.Co-IP檢測Nedd4-2與β/γENaC間的結(jié)合，各條帶灰度值結(jié)果為:以Nedd4-2抗體沉淀蛋白，β/γENaC抗體做western blot，Ctrl組分別為338.5±75.67和341.2±53.95，sham組分別為343.2±58.28和489.1±61.26，兩組間無顯著差異(P＞0.05);HF組分別為1038±162.9和919.6±43.9，比Ctrl組明顯增加(P＜0.05);HF+SPI組分別為

11、172.9±28.39和524.4±58.32，與Ctrl組無顯著差異(P＞0.05)，但顯著低于HF組(P＜0.05)。以β/γENaC抗體沉淀蛋白，Nedd4-2抗體做western blot，Ctrl組分別為78.72±36.47和349.3±97.85，sham組分別為223.8±122.5和495.9±82.81，兩組間無顯著差異(P＞0.05);HF組分別為2000±355.7和1701±354.8，比Ctrl組顯著增加(P

12、＜0.05);HF+SPI組分別為182.6±73和228.4±89.52，與Ctrl組無顯著差異(P＞0.05)，但顯著低于HF組(P＜0.05)。表明心衰大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中的Nedd4-2與ENaC結(jié)合增多，醛固酮受體阻斷劑SPI可以阻斷它們的結(jié)合。
　　6.Western Blotting檢測p-ERK1/2蛋白表達(dá)，計(jì)算條帶灰度相對值結(jié)果為:Ctrl組的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中p-ERK1/2蛋白表達(dá)為1.192±0.0926;sham

13、組為1.087±0.302;HF組為5.210±0.581，比Ctrl組顯著增加(P＜0.005);HF+SPI組為1.021±0.365，與Ctrl組無顯著差異(P＞0.05)，比HF組顯著降低(P＜0.005)。表明HF大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中p-ERK1/2蛋白表達(dá)量顯著升高，提示ERK1/2參與了醛固酮對ENaC的調(diào)節(jié)，醛固酮阻斷劑可以阻斷ERK1/2的激活。
　　結(jié)論:
　　心衰大鼠升高醛固酮水平，通過受體途徑，激活NG的