Clathrin內(nèi)吞途徑在登革病毒進(jìn)入ECV304細(xì)胞過程中作用的研究.pdf

1、登革病毒(dengueviruses，DV)是黃病毒屬(Flavivirus)的單股正鏈RNA病毒，根據(jù)E蛋白的抗原性不同，它分為四個(gè)血清型(DV1，2，3，4)。DV是登革熱(denguefever，DF)和登革出血熱/休克綜合癥(denguehemorrhagicfever/dengueshocksyndrome，DHF/DSS)的病原體。前者為輕型發(fā)熱性疾病，而后者則是危及生命的急癥，病死率可達(dá)5-10％。DHF/DSS的主要臨床

2、表現(xiàn)是血管通透性增加引起的出血和休克，除免疫機(jī)制外，病毒顆粒本身可通過直接或間接途徑作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascμlarendothelialcells，VEC)，影響其功能，進(jìn)而介導(dǎo)DHF/DSS的發(fā)生。因此，了解DV與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，對(duì)于闡明DV的致病機(jī)制，從中尋找防治DHF/DSS的突破點(diǎn)，是當(dāng)前亟待解決的問題。 病毒感染宿主細(xì)胞，必須經(jīng)過吸附、穿入/脫殼、大分子生物合成及組裝、釋放這樣一個(gè)完整的復(fù)制周期，

3、這一過程實(shí)際上是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的過程。為了有效的感染(productiveinfection)宿主細(xì)胞，病毒必須進(jìn)入宿主細(xì)胞、到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的特定區(qū)域才能啟動(dòng)并完成自我復(fù)制，通常DNA病毒需要進(jìn)入細(xì)胞核，而RNA病毒需到達(dá)細(xì)胞核周的區(qū)域。已知真核細(xì)胞中充滿了細(xì)胞器和細(xì)胞骨架，限制分子量大于500kDa分子的自由擴(kuò)散，若不借助細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，病毒顆粒難于通過粘滯的、半流體的細(xì)胞質(zhì)到達(dá)特定目的地。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是感染早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，

4、病毒可在細(xì)胞表面直接穿入胞漿膜進(jìn)入胞漿，或者通過細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)體或細(xì)胞器后再發(fā)生穿入，進(jìn)入胞漿。病毒和細(xì)胞的不同，病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式和途徑也不同，病毒最后的命運(yùn)也不同。目前認(rèn)為，VEC既是DHF/DSS病理過程的效應(yīng)細(xì)胞，也是DV在體內(nèi)增殖的靶細(xì)胞之一，因此，對(duì)DV進(jìn)入VEC機(jī)制的研究，有助于了解DV與VEC相互作用的分子機(jī)制和DV的致病機(jī)制。另外，為阻斷病毒的復(fù)制，采用多肽、蛋白和有機(jī)小分子等阻斷劑阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的策略，比病毒進(jìn)入細(xì)

5、胞后再采取的其它阻斷策略要容易、簡(jiǎn)單和高效，因此研究病毒進(jìn)入VEC的過程和機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步設(shè)計(jì)抗病毒靶向藥物也具有重要意義。 已知外源性大分子如細(xì)菌、病毒等進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要途徑有：(1)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑(clathrin-mediatedendocytosis)：網(wǎng)格蛋白(clathrin)、表皮生長(zhǎng)因子受體激酶的底物15(Eps15)和接頭蛋白(adapterproteins，AP)是該途徑中不可缺少的關(guān)鍵分子；(2)細(xì)

6、胞膜陷穴途徑(caveolae)：陷穴蛋白-1(caveolin-1)在此途徑中發(fā)揮重要作用；(3)巨胞飲途徑(macropinocytosis)。為此，本實(shí)驗(yàn)以臍靜脈來源、能夠支持DV增殖的上皮樣細(xì)胞株ECV304細(xì)胞為研究對(duì)象，通過以下實(shí)驗(yàn)，探索了DV進(jìn)入細(xì)胞的過程和機(jī)制。首先，我們利用免疫熒光雙染色技術(shù)，觀察了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑和細(xì)胞膜陷穴途徑的關(guān)鍵分子Eps15、網(wǎng)格蛋白、接頭蛋白-α(Adaptin-α)、陷穴蛋白-1在感染

7、前后的分布變化，并分析了上述分子與DV-2抗原的共存情況；然后，我們選用氯丙嗪(chlorpromazine)、制霉素(nystatin)和細(xì)胞松弛素D(cytochalasinD)三種藥物分別作用細(xì)胞，以阻滯網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑、陷穴途徑和巨胞飲途徑，再進(jìn)行DV感染實(shí)驗(yàn)，通過噬斑計(jì)數(shù)法(plaqueassay)測(cè)定感染后不同時(shí)相點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度，比較三種途徑病毒進(jìn)入數(shù)量的不同；最后根據(jù)上述結(jié)果，利用RNAi，我們對(duì)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞

8、途徑在DV進(jìn)入細(xì)胞過程中的作用進(jìn)行深入研究。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.免疫熒光染色結(jié)果：DV-2感染后48小時(shí)，鏡下可見較多的DV抗原陽(yáng)性細(xì)胞，病毒抗原主要呈環(huán)狀分布于核周或呈團(tuán)塊狀堆積在核周一側(cè)；激光共聚焦顯微鏡下，在未感染的對(duì)照細(xì)胞中，網(wǎng)格蛋白、Eps15、接頭蛋白-α和陷穴蛋白-1分別均勻的分布于胞漿中；與此不同的是，感染后在DV抗原陽(yáng)性細(xì)胞中，網(wǎng)格蛋白、Eps15和Adaptin-α主要分布在核周，且熒

9、光強(qiáng)度較強(qiáng)，網(wǎng)格蛋白、Eps15與DV-2抗原有明顯的共存，Adaptin-α與DV-2抗原有部分的共存；Caveolin-1的分布在感染后無(wú)明顯變化，且與DV-2抗原共存不明顯。提示DV-2進(jìn)入ECV304細(xì)胞與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑密切相關(guān)。 2.藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果：為進(jìn)一步證明上述結(jié)論，我們選用氯丙嗪、制霉素和細(xì)胞松弛素D三種藥物分別處理細(xì)胞，以阻滯網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑、細(xì)胞膜陷穴途徑和巨胞飲途徑，再進(jìn)行DV感染實(shí)驗(yàn)，通過噬斑計(jì)數(shù)

10、法測(cè)定感染后0h、4h、8h、24h細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度，結(jié)果顯示：與僅實(shí)施感染實(shí)驗(yàn)、未進(jìn)行藥物處理的對(duì)照組比較，三個(gè)藥物處理組的細(xì)胞內(nèi)病毒滴度，在感染后各時(shí)相點(diǎn)均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中氯丙嗪處理組下降最為明顯，感染后0h、4h、8h、24h細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別下降了41％、29％、66％和44％；而細(xì)胞松弛素D和制霉素處理組僅有輕微下降，在感染后0h、4h、8h和24h，細(xì)胞松弛素D組細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別下降了13％、6％、14％和19％，

11、制霉素組細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別比對(duì)照組下降了9％、7％、10％和16％。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明：DV-2可能通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑進(jìn)入ECV304細(xì)胞。 3.RNAi結(jié)果：由于藥物處理對(duì)細(xì)胞的影響可能是多方面和非特異的，所得結(jié)果尚需其他證據(jù)的支持。我們采用RNAi技術(shù)，以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵分子Eps15為靶分子，構(gòu)建了RNAi表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至ECV304細(xì)胞后經(jīng)篩選得到細(xì)胞克隆株ECV304Eps15(-)；間接免疫熒光

12、和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ECV304Eps15(-)中Eps15的表達(dá)下降了76％，證實(shí)我們成功地干擾了Eps15在ECV304細(xì)胞中的表達(dá)；轉(zhuǎn)鐵蛋白是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑的細(xì)胞標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)證明：ECV304Eps15(-)能夠阻止轉(zhuǎn)鐵蛋白的進(jìn)入，說明該克隆株的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑已被特異地阻斷。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們獲得了因Eps15功能缺陷導(dǎo)致網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑被阻滯的ECV304細(xì)胞模型。利用上述細(xì)胞模型，我們實(shí)施了DV-2感染實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)

13、了病毒感染后不同時(shí)相點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)外病毒滴度，結(jié)果顯示感染DV-2后的0h、4h、8h、24h，ECV304Eps15(-)細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別下降了73％、63％、59％和87％；與對(duì)照細(xì)胞ECV304N(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞株)比較，差異非常顯著(P＜0.01)，感染后24h細(xì)胞外病毒滴度ECV304Eps15(-)比ECV304N下降了74％。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明DV-2通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑進(jìn)入ECV304細(xì)胞，而Eps15是DV-