生存素、環(huán)氧化酶-2在白血病中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、生存素、環(huán)氧化酶-2在白血病中的表達(dá)及其臨床意義目的細(xì)胞凋亡受抑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，也是腫瘤對(duì)放療、化療耐藥的機(jī)制之一。目前比較肯定的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的兩大基因家族為bcl-2和凋亡抑制蛋白IAP(inhibitorofapoptosis-protein)家族。生存素(Survivin)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子。生存素基因定位于17q25染色體上，在正常人的胎盤(pán)和胸腺組織中有微弱表達(dá)，在其他正常組織幾乎檢測(cè)不到。生存素在

2、近乎所有的常見(jiàn)惡性腫瘤組織及白血病中都有過(guò)量表達(dá)，并提示患者預(yù)后不良。環(huán)氧化酶是前列腺素合成的限速酶，目前發(fā)現(xiàn)有兩種同功酶即Cox-1，Cox-2。Cox-1是結(jié)構(gòu)性蛋白，參與維持細(xì)胞正常的生理功能。Cox-2基因位于染色體1q25.2-25.3，在多數(shù)組織中，Cox-2是誘導(dǎo)性表達(dá)，但在幾乎所有癌組織中均過(guò)表達(dá)。過(guò)表達(dá)的Cox-2上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2，bcl-2是細(xì)胞凋亡網(wǎng)絡(luò)中最重要的基因，可以阻止或降低放療或化療等引起的細(xì)胞凋亡

3、。 該研究采用免疫組化方法檢測(cè)70例白血病病人骨髓(急性50例，慢性20例)Cox-2、Survivin的表達(dá)情況，同時(shí)結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析，以探討Survivin、Cox-2的異常表達(dá)在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用。 實(shí)驗(yàn)材料收集 選擇1998年1月至2004年10月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液門(mén)診及住院的70例白血病病人骨髓涂片標(biāo)本，男44例，女26例，年齡15～70歲，中位年齡40.3歲。其中急性非淋巴細(xì)胞白血病

4、(ANLL)36例(M12例，M26例，M312例，M44例，M511例，M61例)，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)14例(L13例，L29例，L32例)，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)20例，所有病例均符合血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)。70例病人均于化療前取肝素抗凝的骨髓液(0.2～0.3)ml，用Ficoll(相對(duì)密度1.077)，分離(2000r/min20min)單個(gè)核細(xì)胞，離心涂片機(jī)制片，-20℃保存，所選用病人標(biāo)本的白血病細(xì)胞數(shù)均＞90％

5、。對(duì)照組為10例非血液腫瘤病人骨髓。 試劑：免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連接法(S-P法)，一抗鼠抗人Survivin單克隆抗體(工作濃度1：400)，兔抗人Cox-2單克隆抗體(即用型)，S-P試劑盒。 實(shí)驗(yàn)方法 S-P免疫組化染色：每張涂片先用冷丙酮固定，分別加一抗Survivin，Cox-2，4℃過(guò)夜，再分別加生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化酶溶液(試劑D)室溫孵育，每

6、步驟間均用PBS液沖洗，新鮮配置的DAB溶液顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，自然晾干，封片。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照，慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562做Cox-2，Survivin陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：Cox-2，Survivin陽(yáng)性反應(yīng)均為白血病細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。光鏡下記數(shù)400個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，陽(yáng)性細(xì)胞＞5％為陽(yáng)性病例。應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)方法包括：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn)和spearman秩和相關(guān)分析。

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、Survivin在對(duì)照組和白血病病人中的表達(dá)70例白血病病人中Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率為87.14％(61/70)，。各類(lèi)型白血病中Survivin表達(dá)率分別為ALL64.29％(9/14)，ANLL91.67％(33/36)，CML95％(19/20)，對(duì)照組中Survivin陽(yáng)性率為20％(2/10)。白血病組Survivin陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P=0.0001)。各類(lèi)型白血病中，CML陽(yáng)性表達(dá)率最高

8、，ALL組最低，兩者之間無(wú)顯著差異(P=0.061)，ANLL與CML之間也無(wú)顯著差異(P=1)，而ALL與ANLL之間有顯著差異(P=0.03)。 二、Cox-2在對(duì)照組和白血病病人中的表達(dá)70例白血病病人中Cox-2陽(yáng)性表達(dá)率為78.57％(50/70)，各類(lèi)型白血病中Cox-2表達(dá)分別為ALL50％(7/14)，ANLL83.33％(30/36)，CML90.00％(18/20)，對(duì)照組中Cox-2的陽(yáng)性表達(dá)率為30％(3

9、/10)。Cox-2陽(yáng)性表達(dá)率白血病組明顯高于對(duì)照組有顯著性差異(P=0.004)。各類(lèi)型白血病中Cox-2陽(yáng)性表達(dá)率CML組最高，ALL組最低，二者之間有明顯差異(P=0.017)，ANLL組的陽(yáng)性率高于ALL組(P=0.029)，而ANLL與CML組之間Cox-2陽(yáng)性率無(wú)明顯差異(P=0.697)。 三 Survivin與Cox-2兩者間的關(guān)系70例白血病中同時(shí)檢測(cè)Survivin、Cox-2的表達(dá)，Spearmen相關(guān)系數(shù)

10、為rs=0.499，P＜0.01表明二者密切正相關(guān)。 細(xì)胞凋亡受抑在腫瘤發(fā)生中有重要作用，也是腫瘤對(duì)放、化療耐藥機(jī)制之一。 Survivin是IAP成員中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的蛋白分子，其基因定位于17q25。Survivin組織分布具有明顯的特征性，除胸腺和生殖腺之外，在正常分化組織細(xì)胞中不表達(dá)，而在大多數(shù)腫瘤組織中有廣泛表達(dá)。Nakayama等，Mo-riA等及Adida等研究表明生存素在白血病患者及白血病細(xì)胞系中均有不同程度

11、的表達(dá)，并與白血病的病程發(fā)展，預(yù)后及復(fù)發(fā)相關(guān)。Tamm等采用免疫印跡法檢測(cè)了人類(lèi)60多種腫瘤細(xì)胞的Survivin蛋白表達(dá)，其中有5種血液腫瘤細(xì)胞株：CCRF-CEM(++++)，K562(++)，MOLT-4(++++)，RPMI-8226(+)，SR(++)。 該組資料顯示Survivin在白血病中表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P=0.0001)，與報(bào)道相似，提示其異常表達(dá)參與白血病的發(fā)生。同時(shí)本組資料還顯示ALL與ANLL之間有差

12、異(P=0.03)，而ANLL與CML及ALL與CML之間無(wú)差異。 Cox-2是bcl-2上游的調(diào)節(jié)者，過(guò)表達(dá)的Cox-2使PG合成增加，而使PGE2增加，上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2，抑制細(xì)胞凋亡。因此，Cox-2在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)，但在大多數(shù)人類(lèi)腫瘤中過(guò)表達(dá)，其過(guò)表達(dá)與結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤、肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤浸潤(rùn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。Giles等應(yīng)用Westernblot檢測(cè)了149位慢性粒細(xì)胞白血病人

13、(CML)的Cox-2的表達(dá)，結(jié)果顯示CML中Cox-2表達(dá)顯著增高且與降低患者生存率密切相關(guān)。張廣森等研究表明K562細(xì)胞存在Cox-2蛋白的表達(dá)。 該組資料顯示Cox-2在白血病組中表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(P=0.004)，與報(bào)道相似，提示Cox-2過(guò)表達(dá)參與白血病的發(fā)生。且CML與ALL之間存在明顯差異(P=0.017)，ALL與ANLL之間也存在差異(P=0.035)，而ANLL與CML之間無(wú)差異(P=0.476)。