胰島素血糖依賴性和非依賴性心肌保護作用及抗腎上腺素能心肌保護新機制.pdf

1、研究背景:
　　“葡萄糖-鉀-胰島素”（GIK）極化液作為輔助治療措施用于急性心肌缺血（AMI）的治療已有近半個世紀(jì)的歷史，基于動物及體外實驗的基礎(chǔ)研究均多次證實GIK及其關(guān)鍵成分胰島素在保護缺血心肌方面的有益作用。然而，GIK應(yīng)用于AMI治療的臨床試驗結(jié)果不一，圍繞GIK臨床有效性及其作用機制的諸多爭議性問題，至今在基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域尚未有確鑿的實驗依據(jù)給予明確回答。例如，有學(xué)者撰文分析GIK臨床試驗陰性結(jié)果的可能原因是GIK使

2、用過程中血糖控制不當(dāng)，但這一觀點尚未得到實驗確證，胰島素降糖作用（即血糖依賴性作用）在胰島素心肌保護效應(yīng)中充當(dāng)著怎樣的角色，有待進一步探討，且對于這一問題的研究在GIK/胰島素的臨床應(yīng)用具有重要價值。
　　我們在前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，胰島素除代謝調(diào)節(jié)作用外，可以直接激活心血管內(nèi)源性Akt-eNOS系統(tǒng)，激活細(xì)胞“生存信號”保護缺血心臟。我們和國際上多個實驗室也相繼報道了胰島素糖代謝作用以外的直接心血管保護效應(yīng)，如抑制心肌細(xì)胞凋亡、

3、保護血管內(nèi)皮、抗炎、抗氧化應(yīng)激、正性肌力作用等。然而，以往對于上述胰島素非代謝性效應(yīng)的觀察往往同時與胰島素降糖過程相伴隨，胰島素降糖以外的心肌保護作用與其代謝調(diào)節(jié)作用的相互關(guān)系及各自的作用尚不明確。
　　針對這一問題，最近危重癥治療研究領(lǐng)域根據(jù)臨床和動物實驗結(jié)果率先提出，危重癥治療中胰島素帶來的治療收益完全取決于并得益于其降糖作用，而胰島素降糖以外的作用甚微。然而遺憾的是，上述對于胰島素應(yīng)用于危重癥的臨床和實驗觀察并未評價心臟損傷

4、和心血管終點事件。因此，胰島素在AMI中的心肌保護作用是否應(yīng)完全歸功于其降糖作用，抑或存在血糖非依賴性的直接保護效應(yīng)？闡明胰島素對缺血心肌的保護效應(yīng)與血糖的關(guān)系，并尋找血糖非依賴性心肌保護效應(yīng)存在的直接證據(jù)和作用機制，將對胰島素在AMI的臨床應(yīng)用提供重要的實驗依據(jù)和指導(dǎo)價值。
　　實驗?zāi)康?
　　利用接近于臨床的大動物模型，探討心肌缺血再灌注過程中，胰島素血糖依賴性和非依賴性作用的相互關(guān)系及各自對胰島素心肌保護效應(yīng)的意義和相

5、關(guān)機制。
　　實驗方法
　　1.將犬隨機分為4組：正常胰島素、正常血糖組(NormalInsulin/Euglycemia,NI/NG組);正常胰島素、高血糖組(NormalInsulin/Hyperglycemia,NI/HG組);高胰島素、正常血糖組(HighInsulin/Euglycemia,HI/NG組）;高胰島素、高血糖組(HighInsulin/Hyperglycemia,HI/HG組)。為阻斷因血糖波動引起的

6、內(nèi)源性胰島素釋放，通過結(jié)扎犬胰周血管阻斷胰島素分泌入血。建立犬急性心肌缺血再灌注（MI/R）模型：利用電磁流量計和血管狹窄器制造50分鐘的局部定量缺血，使左前降支（LAD）血流量降低80％，此后釋放狹窄器恢復(fù)血流，再灌注4小時。于再灌注前5分鐘微量泵靜脈輸注50％葡萄糖和GIK極化液用于對血糖和血漿胰島素水平的干預(yù)。
　　2.實時測量血糖，血漿胰島素、C肽水平、游離脂肪酸含量，以進行血糖和胰島素水平控制和代謝評價。于缺血前、缺血后

7、50min及再灌注4h分別同時從前室間隔靜脈和左股動脈取血，立即進行血氣分析，檢測PO2、PCO2、pH、血紅蛋白(Hb)及血樣飽和度(SO2)，用于計算LAD灌注區(qū)心肌組織氧耗率和心肌呼吸指數(shù)。
　　3.通過多道生理記錄和分析處理系統(tǒng)持續(xù)記錄犬心電、冠脈LAD血流量和血流動力學(xué)指標(biāo)。于再灌注結(jié)束后用伊文氏藍(lán)/TTC雙染色法測定心肌梗死面積。血漿肌鈣蛋白T作為心肌損傷標(biāo)志物，用于細(xì)胞壞死程度的評價。采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測Ca

8、spase-3活化及TUNEL凋亡指數(shù)用于定性和定量檢測細(xì)胞凋亡。
　　4.采用石蠟包埋切片的蘇木素-伊紅染色方法，評價再灌注后心肌壞死周邊區(qū)白細(xì)胞浸潤程度，同時測量組織中髓過氧化物酶（MPO）含量以定量評估組織炎癥反應(yīng)水平。檢測組織丙二醛(MDA)含量用于評估脂質(zhì)過氧化水平，測量超氧化物歧化酶(SOD)以評價內(nèi)源性抗氧化能力。
　　5.在數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計過程中采用嚴(yán)格排除標(biāo)準(zhǔn)以保證各實驗組納入的動物樣本具有可比性。
　

9、　實驗結(jié)果:
　　1.本實驗成功建立犬急性心肌缺血再灌注損傷模型。再灌注后心肌出現(xiàn)明顯梗死區(qū)，細(xì)胞凋亡和壞死，及組織炎癥反應(yīng)和氧化損傷。
　　2.胰腺手術(shù)造成的胰腺缺血和局限性炎癥在實驗觀察時程內(nèi)對全身性炎癥反應(yīng)和心臟功能影響甚微。通過平行實驗，在建立心肌缺血再灌注模型前分別實施胰周血管結(jié)扎手術(shù)和假手術(shù)以對比觀察。兩組間血清胰淀粉酶、胰脂肪酶、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的基礎(chǔ)值和術(shù)后5小時測量值

10、均無顯著性差異，且血流動力學(xué)的同步觀測顯示心臟功能亦無明顯變化。
　　3.高血糖存在情況下心肌I/R損傷程度進一步加重。表現(xiàn)為高血糖組較正常血糖組心肌收縮功能恢復(fù)障礙進一步加重，梗死面積擴大，細(xì)胞凋亡和壞死增多，炎癥和氧化損傷加重（NI/HGvs.NI/NG,HI/HGvs.HI/NG,n=8,P<0.05）。
　　4.胰島素干預(yù)可顯著增加冠脈流量，提高代謝效率，增強心肌收縮功能，且這些有益作用不受血糖高低的影響。高胰島素組

11、較正常胰島素組再灌注后收縮功能（心率壓力指數(shù)、最大收縮速率）明顯提高，LAD灌流區(qū)血流量增加，心肌組織葡糖糖攝取率明顯升高，游離脂肪酸（FFA）攝取率輕微下降，心臟呼吸指數(shù)明顯上升（HI/NGvs.NI/NG,HI/HGvs.NI/HG,n=8,P<0.05），提示胰島素誘導(dǎo)心肌氧化代謝底物由FFA向葡萄糖轉(zhuǎn)變。且在心功能明顯改善的前提下，心肌氧耗并未顯著增高，表明心肌氧利用率的提高。
　　5.當(dāng)血糖鉗夾在生理水平時，胰島素水平升

12、高可進一步縮小梗死面積，抑制細(xì)胞壞死和凋亡，降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激(HI/NGvs.NI/NG,n=8,P<0.05)。但此作用需以降糖為前提，高血糖存在時，上述保護作用消失(HI/HGvs.NI/HG,n=8,P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.高血糖可顯著加重心肌損傷并掩蓋胰島素保護作用，因而胰島素降糖作用在其抗I/R損傷保護缺血心肌的效應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色。
　　2.胰島素具有獨立于降糖效應(yīng)、直接的心血管保護作用

13、，其中包括不依賴于血糖控制水平的直接正性肌力作用、冠脈擴張作用及對心肌氧化代謝效率的促進作用。更為重要的是，胰島素減輕心肌損傷，抑制細(xì)胞凋亡，降低組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的有益作用，雖然依賴于正常血糖的維持，但獨立于降糖作用而存在。
　　PartII胰島素抗腎上腺素能心肌保護新機制的研究
　　研究背景:
　　急性心肌缺血發(fā)生時普遍存在著心臟交感-腎上腺素能系統(tǒng)的激活，一系列證據(jù)提示，交感-腎上腺素能活性增強及其介導(dǎo)的兒茶

14、酚胺分泌釋放是加重缺血心肌損傷、誘導(dǎo)致命性心律失常發(fā)生的重要原因之一，且與心臟重構(gòu)、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，兒茶酚胺對心臟的直接作用主要由β-腎上腺素受體(adrenergicreceptor,AR)所介導(dǎo)，因此β受體阻滯劑被廣泛應(yīng)用于臨床AMI的治療。
　　越來越多的證據(jù)表明，胰島素除了在維持心肌代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用外，還在多種生理、病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。通過前述實驗一的研究，我們在大動物MI/R模型上首次證實

15、了胰島素獨立于降糖作用之外直接的心肌保護作用。例如，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素可激活“PI3K-Akt-eNOS”細(xì)胞生存信號抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護冠脈內(nèi)皮，抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進再灌注后心臟功能的恢復(fù)。此外，我們和國際上多個實驗室也發(fā)現(xiàn)了胰島素的直接心臟正性變力作用，表現(xiàn)為在整體動物模型中增強心肌收縮功能，在細(xì)胞水平增強收縮幅度和鈣瞬變。
　　心肌細(xì)胞膜上同時存在著大量的胰島素受體和β受體。已有研究報道，在人脂肪細(xì)胞和平

16、滑肌細(xì)胞中，胰島素可直接對抗兒茶酚胺的脂解作用；相關(guān)分子水平的研究也支持胰島素對β受體信號調(diào)控作用的存在。最近有細(xì)胞實驗顯示，心肌細(xì)胞中PI3K信號可抵消cAMP信號系統(tǒng)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和正性變力作用。然而，在心肌細(xì)胞中，胰島素對β受體激動效應(yīng)可能的調(diào)控作用所知甚少，目前僅有的少數(shù)文獻報道尚存爭議。
　　兒茶酚胺的正性肌力作用主要通過β受體內(nèi)傳，經(jīng)cAMP的生成激活蛋白激酶A(PKA)，進而磷酸化一系列下游分子，參與對興奮-收縮

17、偶聯(lián)的調(diào)控。其中PKA的靶分子之一肌漿網(wǎng)受磷蛋白(PLB)的磷酸化水平可直接調(diào)控SERCA2a活性，而后者是與心肌細(xì)胞Ca2+釋放、攝取、貯存有關(guān)的肌漿網(wǎng)內(nèi)主要鈣轉(zhuǎn)運蛋白之一，也是推動心肌收縮舒張過程的關(guān)鍵蛋白酶。此外，MI/R伴發(fā)的一系列細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變，如兒茶酚胺的大量釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，氧化應(yīng)激等，均可通過改變PLB磷酸化狀態(tài)及SERCA2活性，加重MI/R心肌收縮功能的損傷。然而，MI/R時βAR激活加重心肌損傷，以及胰島素

18、對βAR系統(tǒng)的拮抗作用是否與肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的功能調(diào)節(jié)有關(guān)，目前尚不明確。
　　實驗?zāi)康?
　　本研究旨在探討急性MI/R過程中，胰島素是否對βAR系統(tǒng)具有調(diào)控作用；在回答第一個問題的基礎(chǔ)上，我們將進一步圍繞細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的調(diào)節(jié)，尋求胰島素調(diào)控βAR系統(tǒng)作用的分子機制。
　　實驗方法:
　　1.采用Langendorff離體灌流系統(tǒng)制備大鼠離體心臟缺血再灌注模型。離體灌流心臟隨機分為以下5組：⑴shamM

19、I/R組；⑵MI/R組：30min局部缺血/2h再灌注；⑶MI/R+Ins組：再灌注前5min開始給予10-7mol/L胰島素；⑷MI/R+ISO組：缺血前10min開始給予10-9mol/L異丙腎上腺素（ISO）；⑸MI/R+Ins+ISO組：再灌注前5min給予10-7mol/L胰島素并于再灌注前10min給予10-9mol/LISO直至再灌注結(jié)束。
　　2.于左心室插入充水球囊，由多道生理記錄系統(tǒng)連續(xù)采集左室壓力指標(biāo)，實時測

20、量心臟收縮功能。于再灌注結(jié)束后用伊文氏藍(lán)/TTC雙染色法測定心肌梗死面積。于心肌缺血前15min、缺血30min末、再灌注1h、再灌注2h分別收集冠脈流出液，用分光光度法測定肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）活性。DNAladder方法和TUNEL原位法分別定性和定量測量心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.取再灌注后心肌組織，制備心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)膜蛋白以測定Ca2+-ATPase活性。WesternBlot檢測SERCA2a蛋白表達(dá)水平、P