VEGF在Lewis肺癌微轉移灶形成中的作用及機制研究.pdf

1、肺癌是常見惡性腫瘤之一,嚴重著威脅人類的健康.早期診斷肺癌轉移,尤其是肺癌亞臨床轉移和微轉移(micrometastasis),對于提高肺癌的治愈率和生存率至關重要.目前有關肺癌微轉移機理的研究日益受到重視,良好的實驗模型是準確揭示癌細胞的侵襲、轉移生長特性,進而闡明其機理的基礎.綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是近年來發(fā)現的一種化學性能穩(wěn)定的分子,己經在多種細胞中獲得表達,用于定位蛋白及示蹤

2、細胞等研究.腫瘤血管生成及侵襲是腫瘤轉移的必要條件.血管內皮細胞生長因子 (Vascular endothelial growth factor ,VEGF)是重要的血管生成因子,在人體多數細胞均有表達,通過其受體FLT和KDR誘導新生血管形成.sFLT是其可溶性受體,為VEGF功能抑制劑.近年來研究發(fā)現,VEGF在許多實體瘤中過量表達,與腫瘤血管生成、生長和轉移密切相關.但VEGF與腫瘤微轉移的關系尚未見報道.腫瘤轉移是一系列復雜的事

3、件,突破基底膜是腫瘤細胞進行浸潤和轉移的最初和最關鍵階段,細胞外基質的降解是突破基底膜的必須環(huán)節(jié).基質金屬蛋白酶系統(matrix metalloproteinase,MMP)是組織基底膜和細胞外基質的主降解者,因而MMP在腫瘤侵襲轉移中發(fā)揮重要作用,其中以基質金屬蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的作用尤為重要.近來對血液性腫瘤和卵巢癌組織和等研究表明,VEGF可通過上調腫瘤細胞MMP-2、9的表達,繼而促進腫瘤侵襲.VEGF在肺癌中有

4、無此作用尚未見報道.該研究并以Lewis肺癌細胞(lewis lung carcinoma,LLC)為研究對象,利用基因克隆技術,構建綠色熒光蛋白標記的含鼠VEGF或sFLT全長序列的真核雙表達載體,用脂質體法轉染高轉移Lewis肺癌細胞株,觀察轉染前后的細胞系對細胞生長、血管生成能力及基底膜侵襲能力的改變,并檢測VEGF對金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9表達的影響;將轉染后的細胞接種于C57BL/6J純系小鼠,復制實驗性和自發(fā)性微轉移

5、模型,觀察VEGF對微轉移形成的影響和相關因子表達的變化.最后還進一步從臨床觀察肺癌患者血清VEGF的水平與微轉移的關系.主要結果如下:1. 以綠色熒光蛋白為報告基因,構建重組質粒轉染鼠lewis肺癌細胞,利用腫瘤細胞侵襲實驗、RT-PCR 、Westernblot等技術,觀察轉染后VEGF和sFLT在體外對lewis肺癌細胞株(LLC)侵襲和血管生成能力的影響.發(fā)現:1)利用基因克隆技術,成功構建了pEGFP-VEGF和pEGFP-s

6、FLT真核雙表達載體,并將兩表達載體及pEGFP空載體轉染Lewis肺癌細胞,并分別命名為LLC-VEGF、 LLC-sFLT 和LLC-mock,轉染后的細胞在體外均能穩(wěn)定表達綠色熒光.檢測轉染后的腫瘤細胞發(fā)現,VEGF及sFLT在體外對腫瘤細胞的生長無影響,提示VEGF可能是通過旁分泌途徑作用于腫瘤細胞.2)腫瘤的轉移與腫瘤血管生成及侵襲密切相關.血管內皮細胞粘附并向腫瘤移行才能實現腫瘤的血管生成.采用侵襲小室將腫瘤細胞與血管內皮細

7、胞ECV304共培養(yǎng),模擬體內癌細胞對血管內皮細胞的趨化作用.結果發(fā)現, LLC-mock 組、LLC-VEGF組和LLC-sFLT組遷移到膜背面的內皮細胞數分別是32±7.23個、97±10.26個和10±1.35個.即LLC-VEGF中過表達的VEGF能促進共培養(yǎng)的內皮細胞穿過基質,LLC-sFLT中高表達的sFLT能抑制共培養(yǎng)ECV304的遷移.在腫瘤細胞侵襲實驗中,LLC-mock 組、LLC-VEGF組和LLC-sFLT組穿膜

8、的細胞數分別為34±2.45個、75±15.11個和15±1.41個,統計學分析具有顯著性差異(P<0.05).表明VEGF能促進腫瘤細胞的侵襲能力,sFLT能明顯抑制腫瘤細胞的侵襲能力.上述結果提示VEGF均能增強腫瘤的血管生成能力及侵襲能力.3)MMP-2和MMP-9是主要的腫瘤侵襲因子,RT-PCR和Western Blot技術檢測發(fā)現,VEGF可對其表達在轉錄及翻譯水平都有上調作用,而sFLT可特異性抑制VEGF的作用.由此可見

9、,VEGF可能是通過激活MMP-2、MMP-9的表達促進腫瘤細胞的侵襲能力,sFLT則通過阻斷VEGF的功能,從而抑制MMP-2、MMP-9的表達,降低腫瘤細胞的侵襲能力.4)MMP-2、9以酶原形式分泌入細胞外基質,激活后才能發(fā)揮作用.利用明膠酶譜分析法檢測MMP-2、9的活性時發(fā)現,與LLC-mock組相比,LLC-VEGF組MMP-2和MMP-9的含量均較高,而LLC-sFLT組較低(P<0.05).且MMP-2的含量較MMP-9

10、高 (P<0.01).提示VEGF能增強MMP-2、9的活化,sFLT特異性地阻斷這一效應.結果還顯示,腫瘤細胞以活化MMP-2為主,提示MMP-2可能在腫瘤侵襲轉移中起更為重要的作用.2. 采用小鼠成瘤實驗,復制綠色熒光蛋白標記的實驗性和自發(fā)性微轉移模型,利用免疫組化、RT-PCR 和Western blot等技術,在體研究VEGF和sFLT對Lewis肺癌微轉移灶形成及相關因子表達的影響.結果發(fā)現:1)實驗性和自發(fā)性微轉移模型分別在

11、第2天和1周后檢測到肺內綠色熒光蛋白示蹤的微轉移灶.實驗性微轉移灶在接種后第2、4、7天的平均直徑分別為20μm、40μm和100μm,到接種后10天,平均直徑迅速增大到500μm.2)在Lewis肺癌實驗性和自發(fā)性微轉移形成中,與LLC-mock組相比,LLC-VEGF組能明顯增加微轉移灶的數目和大小,LLC-sFLT組則顯著抑制微轉移灶的形成.提示VEGF能顯著促進LLC-VEGF腫瘤細胞在肺內微轉移灶的形成,sFLT能明顯抑制LL

12、C-sFLT腫瘤細胞在肺內種植.3)在自發(fā)性轉移模型中,與LLC-mock移植瘤相比,LLC-VEGF組小鼠移植瘤微血管密度(MVD)顯著增加.LLC-sFLT移植瘤的MVD比前兩組都顯著降低.提示VEGF能促進小鼠移植瘤的血管生成,sFLT則抑制小鼠移植瘤的血管生成.4)在自發(fā)性轉移模型中,通過RT-PCR分析小鼠移植瘤組織中MMP-2、9的表達時發(fā)現,LLC-VEGF中高表達的VEGF能抑制MMP-2、 9的表達.LLC-sFLT則

13、抑制MMP-2、9的表達;Western blot 檢測蛋白水平變化得到相似的結果.對MMP-2、9的免疫組化染色結果也顯示,LLC-VEGF小鼠移植瘤組織中MMP-2、9呈強陽性,LLC-sFLT小鼠移植瘤組織中該二因子呈弱陽性.說明高表達的VEGF促進移植瘤中MMP-2、MMP-9的表達,高表達的sFLT則抑制MMP-2、MMP-9的表達.5)在實驗性轉移模型和自發(fā)性轉移模型中,隨微轉移灶的不斷形成,血清VEGF的表達水平逐步升高(

14、P<0.05).兩種轉移模型組間比較發(fā)現,LLC-VEGF細胞組中血清VEGF表達水平較其它兩組高.將血清VEGF的表達與實驗性轉移模型中肺部微轉移灶的大小進行相關性分析顯示,兩者呈正相關(r=0.9857, P<0.05).提示血清中VEGF的表達水平可以反映肺內微轉移的情況.3. 采用免疫酶聯技術和RT-PCR,分別檢測130例臨床非小細胞肺癌(NSCLC)患者血清VEGF水平及外周血微轉移標志物CK19mRNA的陽性率.分析血清V

15、EGF水平與NSCLC微轉移的關系.發(fā)現:1)血清VEGF的水平在Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期隨著臨床分期的遞增逐步升高(P<0.01).外周血CK19mRNA陽性率的檢測有類似結果.2)VEGF的表達水平與CK19陽性率顯著相關.CK19陽性者VEGF的表達顯著增加.提示VEGF與肺癌的微轉移相關.3)外周血CK19mRNA與血清VEGF能反映的肺癌轉移情況.總之,該課題從體外侵襲與促血管形成能力的研究及在體內鼠微轉移灶形成與相關因子的研究及

16、臨床肺癌患者血清VEGF水平的分析三個方面,闡述了VEGF促肺癌微轉移形成的作用及其機制.結果表明VEGF能促進Lewis肺癌微轉移灶的形成,其機制主要通過兩條途徑:一是作用血管內皮細胞,導致腫瘤血管生成,間接促進腫瘤微轉移形成、發(fā)展;二是直接作用于腫瘤細胞,上調腫瘤細胞MMP-2、MMP-9的表達及活化,增強腫瘤細胞的侵襲能力,使腫瘤細胞通過溶解基底膜入血轉移.并證明EGFP基因轉染后癌細胞在體內、外可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白,是腫瘤轉移