M4受體及其拮抗劑PD102807在實(shí)驗(yàn)性近視發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、本課題首次檢測(cè)了豚鼠后極部眼球壁組織和人鞏膜成纖維細(xì)胞M4受體表達(dá)，并將新型選擇性M4受體拮抗劑PD102807用于近視模型，研究和探討了M4受體在近視發(fā)生發(fā)展中的作用。 第一部分M4受體及其拮抗劑PD102807在豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視中的作用研究 第一章豚鼠近視模型建立及比較目的建立及比較豚鼠形覺剝奪性近視(FDM)和離焦性近視(LIM)模型 方法4周齡三色豚鼠28只，隨機(jī)分成3組：Ⅰ正常對(duì)照組；Ⅱ形覺剝奪性近視組；

2、Ⅲ離焦性近視組。均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。Ⅱ組以半透明眼罩遮蓋右眼，Ⅲ組配戴-4D凹透鏡片。兩周后測(cè)量3組動(dòng)物右眼屈光度、眼軸長(zhǎng)度。并分別用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察后極部眼球壁組織形態(tài)。 結(jié)果1、模型建立兩周后，形覺剝奪組較對(duì)照眼和正常對(duì)照組眼屈光度、眼軸長(zhǎng)度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；離焦組較對(duì)照眼和正常對(duì)照組屈光度變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而眼軸長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)前后的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。形覺剝奪組與離焦性近視組屈光度、眼軸長(zhǎng)度相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

3、異(P＞0.05)。 2、光鏡下：剝奪眼和離焦性近視眼后極部鞏膜較對(duì)照組明顯變薄，成纖維細(xì)胞密度降低，細(xì)胞外基質(zhì)相對(duì)增多。剝奪眼和離焦性近視眼后極部鞏膜未見明顯差異。 3、電鏡下：剝奪眼和離焦性近視眼與正常對(duì)照組和對(duì)照眼比較，后極部膠原纖維直徑分布明顯不同，其膠原纖維平均直徑顯著減小。且剝奪眼和離焦性近視眼膠原纖維間區(qū)域增大，后極部的纖維密度減小。剝奪眼和離焦性近視眼膠原纖維直徑及纖維密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

4、。 結(jié)論配戴半透明眼罩和凹透鏡片可在短期內(nèi)誘導(dǎo)豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視，成功的建立形覺剝奪性近視和離焦性近視眼實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。兩種模型得到的后極部鞏膜光鏡和電鏡下的形態(tài)相似，和正常鞏膜有顯著差異。 第二章豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜及鞏膜組織M4受體表達(dá)目的檢測(cè)M4受體在豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜及鞏膜組織的表達(dá)及分布 方法4周齡三色豚鼠21只，其中7只動(dòng)物眼球制備石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)后極部球壁組織M4受體表達(dá)與分布；其余動(dòng)物分別

5、提取眼視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜組織RNA和蛋白質(zhì)，RT-PCR、Westernblot檢測(cè)M4受體mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果1、豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜組織均表達(dá)M4受體mRNA，擴(kuò)增產(chǎn)物約為221bp，陰性對(duì)照未見擴(kuò)增產(chǎn)物。 2、Westernblot顯示：豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜及鞏膜組織均表達(dá)明顯的M4受體免疫反應(yīng)活性，分子量約為38kd。陰性對(duì)照組無陽性表達(dá)條帶。 3、免疫組織化學(xué)染色顯示：M4受體分布于豚鼠視網(wǎng)

6、膜RPE細(xì)胞層，光感受器細(xì)胞層、外核層、內(nèi)核層，大多數(shù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，以及內(nèi)從狀層和內(nèi)核層交界區(qū)；大多數(shù)脈絡(luò)膜血管壁以及鞏膜基質(zhì)中也可見M4受體陽性表達(dá)。 結(jié)論豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜及鞏膜組織均有M4受體蛋白表達(dá)。 第三章PD102807抑制豚鼠離焦性近視療效及機(jī)制研究 目的觀察PD102807對(duì)豚鼠離焦性近視的療效，檢測(cè)PD102807對(duì)離焦性近視豚鼠眼鞏膜組織M4受體、decorin核心蛋白以及MMP-2/TIMP-

7、2在mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，探討PD102807抑制近視的鞏膜機(jī)制。 方法4周齡三色豚鼠32只，隨機(jī)分為：Ⅰ正常對(duì)照組；Ⅱ單純離焦組；Ⅲ0.1N鹽酸對(duì)照組；ⅣPD102807治療組(2％PD102807溶解于0.1N鹽酸溶液)。均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組豚鼠的右眼配戴-4D凹透鏡片。藥物對(duì)照組和PD102807組的實(shí)驗(yàn)眼分別隔日玻璃體腔內(nèi)注射0.1N鹽酸溶液和2％PD102807溶液。兩周后檢測(cè)4組動(dòng)物右眼屈光度、眼

8、軸長(zhǎng)度。熒光定量PCR、RT-PCR、Westernblot檢測(cè)M4受體、decorin核心蛋白以及MMP-2/TIMP-2在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)。 結(jié)果1、治療兩周后，PD102807治療組和離焦組及鹽酸組相比，眼屈光度分別增加2.06D±1.36D、1.00D±0.96D(P＜0.01)。眼軸長(zhǎng)度分別縮短了0.13mm±0.17mm、0.14mm±0.19mm，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P＞0.05)。PD102807治療

9、組與正常組相比，屈光度減少1.44D±1.70D，(P＜0.05)；眼軸長(zhǎng)度增加0.04mm±0.10mm，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P＞0.05)。離焦組與正常組相比，各項(xiàng)指標(biāo)差異顯著(P＜0.05)，與鹽酸組比較各項(xiàng)指標(biāo)無顯著性差異(P＞0.05)。 2、探針法熒光定量PCR顯示：PD102807組鞏膜組織M4受體mRNA表達(dá)量分別為離焦組和鹽酸組豚鼠眼的7.35倍和5.06倍；較正常組減少了25.45％；離焦組與正常組相比，

10、M4受體mRNA表達(dá)量降低89.85％，與藥物對(duì)照組無顯著差異。Westernblot顯示：PD102807組M4受體蛋白表達(dá)較離焦組和鹽酸組升高，而較正常組降低；離焦組M4受體蛋白表達(dá)量較正常組明顯降低，與鹽酸組無顯著差異。 3、染料法(SYBRGreenⅠ)熒光定量PCR顯示：PD102807組鞏膜組織decorinmRNA表達(dá)量分別為離焦組和鹽酸組豚鼠眼1.53倍和1.37倍，較正常組減少8.01％；離焦組與正常組相比，d

11、ecorinmRNA表達(dá)量降低39.95％，與藥物對(duì)照組無顯著差異。Westernblot顯示：PD102807治療組decorin核心蛋白表達(dá)較離焦組和鹽酸組升高，較正常組降低。離焦組decorin核心蛋白表達(dá)量較正常組明顯降低。 4、RT-PCR顯示：PD102807治療組與離焦組和藥物對(duì)照組相比，MMP-2的表達(dá)水平顯著降低，TIMP-2水平明顯升高；與正常組相比，MMP-2的表達(dá)水平升高，TIMP-2水平降低。離焦組與正

12、常組相比，MMP-2mRNA的表達(dá)顯著升高，TIMP-2mRNA表達(dá)水平明顯降低，與鹽酸組無顯著性差異。Westernblot印跡顯示：PD102807組和離焦組及鹽酸組相比，MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著下降，TIMP-2顯著升高；和正常組相比，MMP-2表達(dá)水平升高，TIMP-2水平下降；離焦組與正常組相比，MMP-2的表達(dá)水平顯著升高，TIMP-2的水平明顯下降，與鹽酸組無顯著差異。 結(jié)論1、豚鼠離焦性近視形成過程中，M4受體

13、數(shù)目下調(diào)，后極部鞏膜組織decorin合成積累降低，MMP-2/TIMP-2表達(dá)增高。鞏膜組織M4受體可能參與豚鼠離焦性近視的形成； 2、玻璃體腔注射M4受體拮抗劑PD102807能部分抑制豚鼠離焦性近視的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制可能為從轉(zhuǎn)錄水平增加M4受體表達(dá)，降低MMP-2/TIMP-2水平，促使decorin合成積累增加，從而延緩近視的進(jìn)展。 第二部分人鞏膜成纖維細(xì)胞M4受體表達(dá)及PD102807對(duì)其增殖抑制的研究

14、 第一章PD102807對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞增殖抑制作用觀察目的構(gòu)建體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察PD102807對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞的增值抑制作用。 方法原代培養(yǎng)并鑒定人鞏膜成纖維細(xì)胞；MTT法檢測(cè)PD102807對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞增殖影響的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)；流式細(xì)胞法檢測(cè)PD102807對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期效應(yīng)。 結(jié)果PD102807抑制HSF增殖，并呈劑量依賴性。半數(shù)抑制濃度(IC50)為20μM。當(dāng)藥物濃度≥50μ

15、M時(shí)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞調(diào)亡；20μMPD102807在48小時(shí)顯著抑制鞏膜成纖維細(xì)胞增殖(P＜0.05)，并呈時(shí)間依賴性。PD102807可顯著增加鞏膜成纖維細(xì)胞的G1/0期細(xì)胞，減少S期細(xì)胞，降低細(xì)胞增殖指數(shù)，與對(duì)照組的差異有顯著性(P＜0.05)，并呈量效關(guān)系。 結(jié)論P(yáng)D102807顯著抑制人鞏膜成纖維細(xì)胞增殖，且在一定藥物終濃度范圍內(nèi)呈劑量和時(shí)間依賴性，可能通過增加鞏膜成纖維細(xì)胞的G1/0期細(xì)胞，減少S期細(xì)胞來達(dá)到增殖抑制作

16、用。 第二章PD102807對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞M4受體表達(dá)的影響目的觀察人鞏膜成纖維細(xì)胞M4受體表達(dá)，檢測(cè)PD102807對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞對(duì)M4受體表達(dá)的影響。 方法培養(yǎng)細(xì)胞分別加入0、20、30μMPD102807。72h后，分別提取各組細(xì)胞RNA和蛋白，熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot分別檢測(cè)M4受體mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)。 結(jié)果1、正常人鞏膜成纖維細(xì)胞表達(dá)M4受體mRNA，與正常人鞏

17、膜成纖維細(xì)胞表達(dá)M4受體mRNA表達(dá)量相比，M4受體mRNA表達(dá)量在20μMPD102807組降低39.18％，30μMPD102807增加256.73％。 2、ICC結(jié)果顯示：人鞏膜成纖維細(xì)胞在胞膜和胞質(zhì)均表達(dá)M4受體蛋白。藥物干預(yù)結(jié)果顯示20μM組M4受體蛋白表達(dá)呈陽性(++)，兩者在人鞏膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平無顯著性差異；30μM組染色呈強(qiáng)陽性(+++)，與0μM組相比染色明顯增強(qiáng)，差異顯著。 3、Western