PDTC單用或聯(lián)合順鉑對SiHa細(xì)胞增殖和凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)單用及聯(lián)合順鉑體外對人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡及對SiHa細(xì)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)活性的影響，探討PDTC體外抗宮頸癌作用的價(jià)值和機(jī)制，進(jìn)一步探討在宮頸癌NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與順鉑耐藥性的關(guān)系。 方法： 1.通過體外培養(yǎng)宮頸癌SiHa細(xì)胞，采用WST-8方

2、法檢測不同濃度PDTC、DDP及兩者聯(lián)合應(yīng)用對SiHa細(xì)胞生長抑制率的影響。 2.Hoechst33258染色檢測PDTC和DDP作用后SiHa細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)改變。 3.采用流式細(xì)胞儀和AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒檢測不同濃度PDTC、DDP及兩者聯(lián)合應(yīng)用對SiHa細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡和壞死率的影響。 4.提取核蛋白進(jìn)行凝膠遷移變動(dòng)分析(electrophoreticmobilityshifta

3、ssay，EMSA)檢測SiHa細(xì)胞內(nèi)NF-κB的組成性激活及不同濃度PDTC在不同時(shí)間對組成性激活的抑制；同時(shí)檢測TNF(50ng/ml)刺激30min和不同濃度DDP刺激45min后對SiHa細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性的誘導(dǎo)性激活及不同濃度PDTC對誘導(dǎo)性激活的抑制。 結(jié)果： 1.PDTC能有效抑制人宮頸癌細(xì)胞株SiHa的生長，并且具有濃度依賴性，濃度為50PM以上具有時(shí)間依賴性(P＜0.01)；順鉑可以抑制SiHa細(xì)胞增

4、殖，并呈濃度與時(shí)間依賴性，在24h，在0.01-1.0μg/ml低濃度時(shí)對SiHa細(xì)胞的抑制作用不明顯；在1.0-20μg/ml之間隨順鉑濃度的升高，抑制作用逐漸加強(qiáng)，但均未達(dá)到IC50；在48h，在0.01-0.1μg/ml低濃度時(shí)對SiHa細(xì)胞的抑制作用不明顯，在0.1-10μg/ml之間隨濃度的升高，抑制作用逐漸加強(qiáng)，大于10μg//ml后，隨濃度升高抑制作用增加不明顯(P＞0.05)。聯(lián)合用藥顯示，PDTC聯(lián)合應(yīng)用順鉑能顯著提高

5、順鉑的細(xì)胞毒性，并具有協(xié)同效應(yīng)。 2.PDTC50μM和DDP5μg/ml作用SiHa細(xì)胞24h后Hoechst33258熒光染色可見凋亡細(xì)胞。 3.PDTC誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死的發(fā)生，早期凋亡率在一定程度上呈濃度依賴性；PDTC100M組晚期凋亡和壞死率與其他組比較明顯升高(P＜0.01)；順鉑誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死的發(fā)生，并在一定程度上呈濃度依賴性；PDTC聯(lián)合順鉑可以使SiHa

6、細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡和壞死率均有明顯升高，顯示具有協(xié)同效應(yīng)。 4.宮頸癌細(xì)胞株SiHa核內(nèi)存在NF-κB的組成性激活，PDTC可以抑制組成性激活(constitutiveNF-kappaBactivity)，在4h時(shí)抑制作用最強(qiáng)，且呈濃度依賴性，其抑制強(qiáng)度與24h細(xì)胞生長抑制率呈直線正相關(guān)(r=0.931，P=0.035)，與PDTC作用48h致早期凋亡率呈曲線正相關(guān)(r=1.000，P=0.011)；TNF和DDP誘導(dǎo)Si

7、Ha細(xì)胞核內(nèi)NF-κB活性的增加，用PDTC預(yù)處理可抑制TNF和DDP的誘導(dǎo)性激活，PDTC預(yù)處理組與未經(jīng)PDTC預(yù)處理組比較NF-κB活性明顯下降(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.PDTC可抑制SiHa細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制SiHa細(xì)胞NF-κB的組成性激活；PDTC對SiHa細(xì)胞的致凋亡作用可能與其抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動(dòng)凋亡程序有關(guān)。 2.DDP能抑制SiHa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但SiHa

8、細(xì)胞對順鍆存在一定的耐藥；同時(shí)DDP能誘導(dǎo)NF-κB的激活；PDTC增加SiHa細(xì)胞對DDP的敏感性，其機(jī)制可能與PDTC抑制DDP引起NF-κB的誘導(dǎo)性激活，進(jìn)而影響NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。 3.抗氧化劑PDTC既可以抑制SiHa細(xì)胞NF-κB的組成性激活，又可以抑制TNF和DDP引起的NF-κB誘導(dǎo)性激活，其可以作為NF-κB抑制劑用于宮頸癌研究。 4.抗氧化劑PDTC有望為宮頸癌化學(xué)防治帶來新的前景。