內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物與1型糖尿病大鼠心功能及心肌線粒體功能障礙.pdf

1、一、研究背景和目的:
　　 糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，糖尿病并發(fā)心血管疾病，尤其是糖尿病心肌病已成為糖尿病病人死亡的重要原因。然而，其發(fā)病機(jī)制不清楚。糖尿病心肌病是一類不依賴動脈粥樣硬化和高血壓存在的特殊性、非缺血性心肌病。臨床最早出現(xiàn)左心室舒張功能障礙，并左心室順應(yīng)性降低和左心室肥厚;然后發(fā)展為收縮功能障礙，左心室擴(kuò)張并出現(xiàn)各種心律失常以致心力衰竭。糖尿病心肌病的主要病理改變是心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損害、內(nèi)膜下纖維增生、

2、毛細(xì)血管基底膜增厚、間質(zhì)炎癥、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等。臨床上糖尿病主要分為1型和2型糖尿病;雖然臨床上90％的糖尿病都是2型糖尿病，但1型糖尿病大多發(fā)病早，在青少年期間就發(fā)病，故病程長;而且治療上依賴胰島素，因此更易并發(fā)心血管并發(fā)癥。越來越多的文獻(xiàn)報道，糖尿病心肌病與線粒體功能障礙密切相關(guān);我室近年來也研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飼養(yǎng)加小劑量的鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠，血中內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非對稱二

3、甲基精氨酸(ADMA)明顯升高，并與心肌線粒體功能障礙和線粒體生物合成降低有關(guān);但未同步檢測糖尿病大鼠心功能的變化。因此，本研究擬在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠，進(jìn)一步探討內(nèi)源性ADMA升高與糖尿病心功能不全和心肌線粒體功能障礙三者之間的關(guān)系，為闡明糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制提供新的實驗數(shù)據(jù)。
　　 二、方法:
　　 1、動物實驗:給兩月齡體重在200～220 g的雄性SD大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(65 mg/k

4、g，溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH4.2)以制備1型糖尿病大鼠模型;采用頸動脈插管至左心室直接檢測血流動力學(xué)和心功能指標(biāo)的變化;測定心肌組織ATP含量，用RT-PCR檢測心肌組織解偶聯(lián)蛋白(UCP2)的轉(zhuǎn)錄水平;用PCR及RT-PCR測定心肌組織線粒體基因:細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COXⅠ)與核基因:β-actin拷貝數(shù)的比值以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ線粒體生物合成;用高效液相色譜測定大鼠血清中ADMA濃度，用Weste

5、rn blotting檢測心肌ADMA的主要合成酶:蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（PRMT1）和ADMA主要代謝酶:二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)，以及內(nèi)皮型NOS(eNOS)和誘導(dǎo)性NOS(iNOS)蛋白表達(dá)，用比色法測定心肌組織DDAH及NOS活性以及NO代謝產(chǎn)物含量，以反映心肌組織PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路的變化;還測定心肌組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物:丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶:超氧化物岐化酶(SOD)活性以反

6、應(yīng)氧化應(yīng)激。
　　 2、細(xì)胞實驗用內(nèi)源性NOS抑制物ADMA和外源性NOS抑制物L(fēng)-硝基精氨酸（L-NNA）或L-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）孵育培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞48h，然后用Western blotting檢測心肌細(xì)胞中PRMT1/DDAH/ADMA/NOS通路蛋白的表達(dá)改變。
　　 三、結(jié)果:
　　 1、動物實驗:與正常大鼠相比，STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠血糖明顯升高，尿糖呈強陽性，體重明顯

7、下降，心臟質(zhì)量也下降，使心指數(shù)（HMI）相對增加;糖尿病模型大鼠心率(BPM)比正常大鼠明顯減慢，心動周期延長，收縮期也延長;左心室等容舒張壓平均變化速率(IRP Average dp/dt)明顯降低，舒張期左心室內(nèi)壓下降最大變化速率(Min dp/dt)也顯著減慢，反應(yīng)糖尿病大鼠心臟舒張功能明顯損害;此外，左心室收縮壓(Max pressure)降低，舒張壓(Min pressure)升高，左心室舒張末壓(EDP)也升高，這些指標(biāo)雖無

8、統(tǒng)計學(xué)上的顯著性，但是左心室發(fā)展壓(Max-Min pressure)明顯降低，提示心臟收縮功能也受到輕度損害。與正常對照組大鼠比較，糖尿病大鼠心肌組織反映線粒體DNA含量的COXⅠ/β-actin比值明顯降低，線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子即PGC-1α的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，表示糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成減少;解偶聯(lián)蛋白UCP2轉(zhuǎn)錄水平升高，但是心肌組織ATP含量卻是增加的。與正常對照組大鼠比較，糖尿病大鼠血清中ADMA濃度明顯升高，心肌組織D

9、DAH活性有降低趨勢，NOS活性明顯無變化，iNOS活性增加，NO代謝產(chǎn)物增加;糖尿病大鼠心肌組織ADMA的主要產(chǎn)生酶PRMT1蛋白表達(dá)上調(diào)，而主要分布在心血管系統(tǒng)的ADMA主要代謝酶DDAH2的蛋白表達(dá)則降低，DDAH1表達(dá)無明顯改變;iNOS表達(dá)上調(diào)，而eNOS表達(dá)降低，提示糖尿病時內(nèi)源性ADMA升高是由于其生成酶PRMT1上調(diào)和其代謝酶DDAH2表達(dá)下調(diào)所致。經(jīng)相關(guān)性分析，內(nèi)源性ADMA濃度與左心室發(fā)展壓(Max-min pres

10、sure)呈負(fù)相關(guān)，而與左室舒張壓下降的最大速率(Min dp/dt)呈正相關(guān);此外，內(nèi)源性ADMA濃度還與線粒體DNA含量或線粒體生物合成呈負(fù)相關(guān)，而與UCP2轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。
　　 2、細(xì)胞實驗結(jié)果:用內(nèi)源性NOS抑制物ADMA和外源性NOS抑制物L(fēng)-NNA或L-NAME孵育培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞48h，明顯增加ADMA主要生成酶PRMT1表達(dá)，降低ADMA主要代謝酶DDAH1和DDAH2的表達(dá)，上調(diào)iNOS表達(dá)

11、，而eNOS表達(dá)無明顯變化;此結(jié)果與糖尿病大鼠心肌組織PRMT1/DDAH/NOS通路的蛋白表達(dá)一致。
　　 四、結(jié)論:
　　 1、糖尿病大鼠內(nèi)源性NOS抑制物ADMA含量明顯增加，可能是由于其合成酶PRMT1的蛋白表達(dá)上調(diào)和其主要代謝酶DDAH2的蛋白表達(dá)下調(diào)所致;
　　 2、糖尿病大鼠心臟舒張功能明顯損害，收縮功能輕度受損;
　　 3、糖尿病大鼠心肌線粒體生物合成明顯抑制，可能是其主要調(diào)節(jié)因子PGC-