CCK-,8-刺激小鼠神經(jīng)元EGFR磷酸化的動力學(xué)研究.pdf

1、目的：本研究擬采用細胞培養(yǎng)、免疫印跡等方法，觀察八肽膽囊收縮素(octopeptide-cholecystokinin，CCK8)刺激小鼠神經(jīng)元后，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)磷酸化水平的改變，并分析CCK8刺激神經(jīng)元不同時間點，EGFR磷酸化的動力學(xué)特征，以獲得CCK8與EGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑交叉對話(cross talk)的相關(guān)信息。 方法： 1、體外培養(yǎng)

2、小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。取出生1～2d的乳小鼠大腦皮質(zhì)，經(jīng)胰蛋白酶消化分離后，加入DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后改用神經(jīng)元培養(yǎng)基Neurol Medium和B27培養(yǎng)，5～7d后可獲得形態(tài)典型、高密度的神經(jīng)元。 2、用神經(jīng)特異性烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)免疫組織化學(xué)方法對神經(jīng)元進行鑒定。待細胞生長至第7d，將其固定、封閉后加入一抗NSE、生物素化山羊抗小鼠IgG二抗結(jié)合，用DAB顯色后顯微

3、鏡下觀察結(jié)果并拍照。 3、CCK8、EGF刺激后，神經(jīng)元EGFR磷酸化狀態(tài)分析。將培養(yǎng)的細胞隨機分成實驗組和對照組，實驗組分別采用CCK8(10-7mol/L)、EGF(40ng/ml)、CCK8(10-7mol/L)+EGF(40ng/ml)刺激神經(jīng)元，對照組采用等量培養(yǎng)基，刺激5min后裂解細胞，提取蛋白質(zhì)，進行SDS-PAGE凝膠電泳，用抗磷酸化EGFR抗體進行免疫印跡，用Qutity One軟件對免疫印跡結(jié)果圖象進行灰度

4、掃描，以β-action蛋白作為內(nèi)參照進行標準化，并分析組間結(jié)果是否存在差異。 4、CCK8刺激EGFR磷酸化的動力學(xué)分析。CCK8(10-7mol/L)刺激神經(jīng)元不同時間(0、3、5、10、30min)后，液氮中止反應(yīng)，裂解細胞，提取蛋白質(zhì)，按上述方法進行EGFR的磷酸化分析，比較各個時間點磷酸化水平的改變，并繪制時間動力學(xué)曲線。 結(jié)果： 1、Neurol Medium和B27培養(yǎng)基中因有多種生長因子，可選擇性

5、的促進神經(jīng)元生長，抑制膠質(zhì)生長，用其培養(yǎng)的新生鼠大腦皮質(zhì)5-7d后在顯微鏡下可見形態(tài)典型、生長良好、密度高、較為純化的神經(jīng)元。 2、對培養(yǎng)的細胞采用神經(jīng)元標志物烯醇化酶(NSE)進行免疫組織化學(xué)鑒定，結(jié)果顯示大多數(shù)細胞染色呈陽性反應(yīng)，可以確定為神經(jīng)元。 3、神經(jīng)元提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，可見譜帶整齊，沒有拖尾和彌散，在分子量170KD處可見清晰的EGFR譜帶，免疫印跡后可以得到清晰的磷酸化EGFR譜帶，

6、表明本研究所建立的小鼠神經(jīng)元磷酸化蛋白質(zhì)的檢測方法是成功的。 4、分別用CCK8、EGF、CCK8+EGF刺激神經(jīng)元后，免疫印跡分析結(jié)果顯示上述不同刺激后EGFR磷酸化水平存在差異(P<0.05)，與對照組比較，CCK8、EGF分別刺激后EGFR的磷酸化水平均增強，但是CCK8+EGF刺激后則更為顯著，表明CCK8可刺激EGFR的磷酸化，且存在和EGF的協(xié)同作用。 5、CCK8刺激神經(jīng)元0、3、5、10、30min后得到

7、EGFR磷酸化水平的時間動力學(xué)曲線呈峰型，5min達到最高，之后開始下降，30min時曲線又有輕微地上揚，表明CCK8刺激EGFR磷酸化可能存在快速和遲發(fā)的不同機制。 結(jié)論： 1、本研究成功地建立了小鼠神經(jīng)元EGF受體磷酸化的免疫印跡分析方法； 2、CCK8可導(dǎo)致神經(jīng)元中EGFR磷酸化水平改變，表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CCK8與EGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間存在cross talk，這種不同信號分子之間的相互交流可能成為CCK