PPAR-α對ET-1誘導的心肌肥厚和Akt-GSK3β-NFATc4信號通路的影響.pdf

1、第一部分PPAR-α激動藥和PPAR-α過表達對ET-1誘導的心肌細胞肥大及PI3K/Akt/GSK3 β-NFTc4通路的影響。 目的：PPAR-α是核受體PPARs的一種亞型，主要在心臟表達，充當了心肌肥厚的抑制因子。日益增多的證據(jù)表明，PPAR-α的下調和滅活可能參與了高血壓左心室病變的發(fā)病過程。盡管PPAR-α已經(jīng)被報道是心肌肥厚的重要調節(jié)因子，但是PPAR-α激活后抑制心肌肥厚的機制還未完全明了。因此，我們采用PPAR

2、α激動藥非諾貝特(fenofibrate)和PPAR-α-EGFPN3質粒作為干預藥物，研究了PPAR-α激活后是否通過：PI3K/Akt/GSK-3 β-NFATc4通路抑制內皮素-1(endothelin-1，ET-1)誘導的心肌肥大反應。 方法：本研究以體外培養(yǎng)的新生SD大鼠的心肌細胞作為試驗模型，通過構建PPAR-α-EGFPN3質粒來研究：PPARα過表達對ET-1誘導的Akt/GSK-3 β磷酸化和ET-1誘導的NF

3、ATc4核轉位的影響。采用[<'3>H]亮氨酸摻入法、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Westem blot)技術、免疫熒光技術、免疫共沉淀技術等方法，觀察了(1)非諾貝特對ET-1誘導的心肌細胞肥大及表型轉變的影響；(2)ET-1對PPAR-α mRNA和蛋白表達的時效關系；(3)非諾貝特和PPAR-α過表達對ET-1誘導的Akt/GSK3 β磷酸化的影響；(4)非諾貝特和PPAR-α過表達對ET-1誘導的NFAT

4、c4核轉位的影響；(5)非諾貝特對PPAR-α和NFATc4相互作用的影響；(6)非諾貝特對ET-1誘導的AP-1表達的影響。 結果： 1.PPAR-α激動劑非諾貝特(10 μmol/L)顯著抑制了ET-1誘導的肥厚反應(心肌細胞表面積、蛋白質合成和ANF的表達的增加)。 2.以10 nmol/L的ET-1刺激，PPAR-α mRNA的表達在1h、3h、6h出現(xiàn)降低，以3h和6h降低較為明顯；而PPAR-α蛋白的

5、表達在3h、6h出現(xiàn)降低，其中以3h降低最為顯著。 3.10 nmol/L ET-1作用3h后，Akt 473位和GSK3 β 9位絲氨酸磷酸化表達顯著增加；以非諾貝特(10 μmol/L)預處理1h，ET-1誘導的Akt和GSK3 β的磷酸化被顯著降低；LY294002(10 gmol/L，P13K抑制劑)可以阻斷ET-1誘導的Akt/GSK3 β磷酸化。 4.PPAR-α過表達或PPAR-α過表達聯(lián)用非諾貝特(10

6、μmol/L)可以顯著抑制ET-1誘導的Akt/GSK3 β磷酸化。 5.非諾貝特和PPAR-α過表達防止了ET-1誘導的NFATc4由胞漿到胞核的轉位。 6.在心肌細胞中PPAR-α和NFATc4之間存在相互作用，但在非諾貝特處理時，二者之間的作用被加強。 7.非諾貝特抑制了ET-1誘導的AP-1的表達；LiCl(10 mmol/L)處理逆轉了非諾貝特對AP-1的作用，增加了ET-1誘導的AP-1的表達。

7、 結論： 1.ET-1可能通過激活P13K/Akt?GSK-3 β-NFATc4通路和下調PPAR-α誘導心肌肥厚的發(fā)生。 2.PPAR-α激活后可能通過抑制P13K/Akt/GSK-3 β-NFATc4通路抑制ET-1誘導的心肌肥大反應。 第二部分RNA干擾沉默PPAR-α對ET-1和非諾貝特調控的心肌細胞肥大及P13K/Akt/GSK3 β-NFALTc4通路的干預效應。 目的：本研究的目的是闡明P

8、PAR-α在病理性心肌肥厚中的作用及其機制。我們應用siRNA有效沉默PPAR-α，調查了PPAR-αsiRNA和PPAR-α激動劑非諾貝特在ET-1誘導的Akt/GSK3β磷酸化和NFATc4核轉位中的作用；驗證了非諾貝特對心肌肥厚的抑制作用是PPAR-α依賴性的這一假說。 方法：應用siRNA有效沉默心肌細胞PPAR-α的表達；采用RT-PCR和Western-blot試驗檢測了Invitrogen’s Stealth RN

9、Ai對PPAR-α基因的沉默效應和序列特異性；運用[<'3>H]亮氨酸摻入法和RT-PCR檢查了心肌細胞蛋白質合成和ANF mRNA的表達；采用Western-blot技術研究了ET-1和非諾貝特對P13K/Akt/GSK3β信號通路的影響及PPAR-α siRNA對其的干預作用。 結果： 1.與對照組相比RSS304167，RSS304168和RSS304169可分別減少PPAR-α的mRNA表達70﹪，92﹪，and

10、 62﹪；同時，RSS304167，RSS304168和RSS304169可以分別降低PPAR-α蛋白表達49﹪，75﹪，and 44﹪；此外，RSS304168并不影響PPARβ/δ的PPAγ的mRNA和蛋白表達。 2.和轉染對照組相比，ET-1刺激使心肌細胞蛋白質的合成增加大約70﹪(1.7.3 ±0.12 fold vs.negative control)，但RSS304168處理增加了ET-1誘導的蛋白質合成，和轉染對照

11、組相比，RSS304168聯(lián)用ET-1組蛋白質合成增加大約120﹪；此外，ET-1顯著增加了ANF的mRNA表達(1.76 ±0.12 fold vs.negativecontrol)而RSS304168加強了ET-1的這種作用(2.14 ±0.16 fold vs negativecontrol)。 3.應用RSS304168沉默PPAR-α后，非諾貝特抑制心肌細胞蛋白質合成和ANF表達的作用被顯著逆轉。 4.利用RS

12、S304168沉默PPAR-α基因后，非諾貝特降低ET-1誘導的Akt/OSK3β磷酸化的作用被取消；而ET-1刺激的Akt/GSK3β的磷酸化水平被升高，但這種作用可被P13K阻斷劑LY294002所阻斷。 5.PPAR-α基因沉默后，ET-1誘導NFATc4核轉位的作用被加強；而非諾貝特抑制ET-1誘導的NFATc4核轉位的作用被RSS304168逆轉。 結論：ET-1通過激活P13K/Akt/GSK3 β-NFAT

13、c4通路誘導心肌細胞肥大反應，這種作用可能與PPAR-α有關；非諾貝特以PPAR-α依賴的方式抑制了P13K/Akt/GSK3 β-NFATc4通路，防止了心肌肥大的發(fā)生。 第三部分非諾貝特對壓力超負荷大鼠左心室肥厚及心肌組織Akt/GSK3 β-NFATc4信號通路的影響。 目的：本實驗通過縮窄大鼠腹主動脈建立心肌肥厚模型，研究了非諾貝特逆轉AAB大鼠左心室肥厚的作用，初步探討了P13K/Akt/GSK3 β途徑和NF

14、ATc4在非諾貝特調控的心肌肥大過程中的信號轉導作用，從分子水平上為逆轉高血壓LVH提供新的理淪和實驗依據(jù)，也為臨床防治高血壓LVH提供新的治療思路。 方法：采用腹主動脈縮窄法(AAC)建立心肌肥厚模型。健康SD雄性大鼠50只，體重150±10g，隨機分為：(1)假手術組；(2)假手術組+非諾貝特(80 mg/kg per day)組；(3)AAC組；(4)AAC+非諾貝特(80 mg/kg per day)組。 結果：

15、 1.與對照組相比，大鼠腹主動脈縮窄4周后，AoSP、AoDP、LVESP以及LVEDP明顯升高；+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯減少，這說明AAC大鼠出現(xiàn)了心臟收縮、舒張功能的障礙，在體心功能明顯下降。而非諾貝特治療后，±dp/dtmax明顯上升；AoSP、AoDP、LNESP無明顯變化而LVEDP稍降。 2.與對照組相比，手術后4周AAC大鼠的室間隔(IVSd和IVSs)及左室后壁厚度(PWTd和PWTs)

16、均明顯增加，同時左室收縮期內徑減小(LVEDS)而舒張期內徑(LVEDD)無明顯變化，呈現(xiàn)出明顯的向心性肥厚。經(jīng)非諾貝特治療后，其左室肥厚得到明顯逆轉，左室后壁厚度顯著減小，左室內徑明顯增大，與相應模型組比較，均具有顯著性差異。此外，與對照組相比，AAC組左心室重量指數(shù)(LVM/BW)和心肌細胞橫切面積增加，差異具有顯著性。經(jīng)非諾貝特治療后，其左心室指數(shù)和心肌細胞橫切面積顯著低于相應的模型組。 3.與對照組相比，AAC組的胚型基

17、因ANF和β-MHC的mRNA表達增加；而非諾貝特治療后，ANF和β-MHC的mRNA表達均顯著下降。 4.與對照組相比，AAC大鼠Akt/GSK3 β的磷酸化水平明顯增加；給予非諾貝特治療后，AAC大鼠的Akt/GSK3 β磷酸化水平明顯下降。 5.與假手術組相比，AAC大鼠心肌組織NFATc4的表達升高；而非諾貝特治療部分逆轉了AAC大鼠增高的NFATc4的表達。同時，在各組大鼠均能觀察到：PPAR-α和NFATc4