乙醇對H4-ⅡE細(xì)胞PPAR-α、AMPK-α1表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：本次試驗以大鼠H4-ⅡE細(xì)胞作為研究對象，采用含有不同濃度乙醇之細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，觀察乙醇對H4-ⅡE細(xì)胞PPAR-α、AMPK-α1及細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：1、大鼠H4-ⅡE細(xì)胞以適量濃度接種于培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液（含10％胎牛血清、4500mg/L D-葡萄糖、584mg/L L-谷氨酰胺、3700mg/L Na2CO3、青霉素100u/ml、鏈霉素100μg/ml，pH值7.0～7.4。）置于37℃

2、，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～5日傳代1次，視細(xì)胞密度及后續(xù)操作需求以1:4～1:12比例傳代。分設(shè)對照組和實驗組，實驗組在上述培養(yǎng)液中分別加入乙醇并調(diào)定濃度至0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L。在培養(yǎng)12小時末進(jìn)行凋亡檢測，在培養(yǎng)12h、24h、48h末進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。2、應(yīng)用倒置顯微鏡、HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；免疫組化染色觀察PPARα、AMPKα1在各組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinⅤ

3、-FITC/PI雙染色、TUNEL染色檢測各組細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：1、形態(tài)學(xué)：①倒置顯微鏡：對照組細(xì)胞為梭形，排列密集，體積較大，正常貼壁，胞膜完整，胞質(zhì)豐富，飽滿透亮，分布均勻，核仁大小不一，可見核分裂相；乙醇組細(xì)胞數(shù)量減少明顯，部分明顯變圓，凋亡明顯增多。②HE染色：對照組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞排列致密，細(xì)胞之間空隙少，細(xì)胞體積大，胞漿豐富，胞核染色明顯，胞核中可見多個核仁，可有核分裂相；乙醇組細(xì)胞排列明顯疏松，部分細(xì)胞明顯變圓，

4、胞漿濃縮，視野中凋亡細(xì)胞、顆粒明顯比對照組低濃度乙醇組增多。2、流式細(xì)胞術(shù)：乙醇干預(yù)組H4-ⅡE細(xì)胞正常活細(xì)胞比例較對照組減少（P＜0.05），早期凋亡細(xì)胞比例增多（P＜0.05），晚期凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞比例增多（P＜0.05）。3、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色：對照組：使用 FITC濾鏡（藍(lán)光）觀察，極少數(shù)細(xì)胞可見紅色熒光，使用Rhodamine濾鏡（綠光）觀察，少數(shù)細(xì)胞可見綠色熒光；乙醇組細(xì)胞：使用FITC濾鏡觀察，可見較

5、多紅色熒光，使用Rhodamine濾鏡觀察，可見較多綠色熒光，視野中細(xì)胞皺縮明顯，可見較多細(xì)胞碎片。4、TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡：對照組細(xì)胞呈梭形，大多數(shù)細(xì)胞呈無色透明，個別細(xì)胞胞核呈藍(lán)色；乙醇組細(xì)胞排列明顯疏松，部分細(xì)胞明顯變圓，胞核被染色之細(xì)胞數(shù)量較低濃度乙醇組明顯增多（P＜0.05）。5、免疫組化染色：①乙醇對大鼠H4-ⅡE細(xì)胞PPAR-α表達(dá)的影響：與對照組相比，0.5M乙醇處理12h后 H4-ⅡE細(xì)胞 PPAR-α表達(dá)無顯著改

6、變（P＞0.05），其他乙醇組 H4-ⅡE細(xì)胞 PPAR-α表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；②乙醇對大鼠 H4-ⅡE細(xì)胞 AMPK-α1表達(dá)的影響：與對照組相比，0.5M乙醇處理12h后H4-ⅡE細(xì)胞AMPK-α1表達(dá)無顯著改變（P＞0.05），其他乙醇組 H4-ⅡE細(xì)胞 AMPK-α1表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、乙醇減少肝細(xì)胞PPAR-α的表達(dá)；2、乙醇減少肝細(xì)胞AMPKα1的表達(dá)；3、乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與PPA