嬰兒型GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥GLB1基因突變檢測(cè)和GLB1-Exon2 GST融合蛋白的表達(dá).pdf

1、研究背景和目的：
　　 GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥是一種由于溶酶體中酸性β-半乳糖苷酶缺乏所致的常染色體隱性遺傳的鞘脂類儲(chǔ)積病。β-半乳糖苷酶的主要作用是水解神經(jīng)節(jié)苷脂、糖蛋白和糖胺殘基的β-半乳糖。β-半乳糖苷酶基因的突變可導(dǎo)致該酶的缺失或減少,由此β-半乳糖苷酶的缺乏可以引起多種代謝儲(chǔ)積疾病。GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥的臨床表現(xiàn)為GM1神經(jīng)節(jié)苷脂和相關(guān)糖復(fù)合物在不同的組織,尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的儲(chǔ)積,因此除了肝脾腫大、骨骼發(fā)育不全

2、、面部粗糙等臨床特征外,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的受累更為典型,幾乎出現(xiàn)在所有患者的臨床表型中。
　　 根據(jù)該疾病發(fā)病時(shí)間和臨床癥狀嚴(yán)重程度的不同,GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥被分為嬰兒型、少年型和成年型三種類型,每種類型的癥狀表型存在很大差別,這主要是由于患者體內(nèi)β-半乳糖苷酶的活性不同造成的,其癥狀嚴(yán)重程度與β-半乳糖苷酶的殘余活性呈負(fù)相關(guān),其中以嬰兒型患者癥狀最為嚴(yán)重,且病情發(fā)展最為迅速。該疾病做為一種罕見(jiàn)的溶酶體貯積癥,其發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒

3、中約為1/100,000-200,0000,但不同地區(qū)和種族間存在著明顯的差異,在某些人群中存在著較高的發(fā)病率,如羅馬人群中的發(fā)病率高達(dá)1:10,000,國(guó)內(nèi)對(duì)于該疾病的研究較少,發(fā)病情況尚不明確。
　　 人類β-半乳糖苷酶基因(GLB1)位于染色體3p21.33,包含16個(gè)外顯子,橫跨將近62.5Kb。該基因上的突變是導(dǎo)致β-半乳糖苷酶缺乏或活性喪失的直接原因,目前已發(fā)現(xiàn)該基因上存在上百種突變,除可導(dǎo)致GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥外

4、還可引起其他多種疾病。本研究對(duì)一例嬰兒型GM1神經(jīng)節(jié)苷脂患者進(jìn)行了遺傳學(xué)分析。為發(fā)現(xiàn)該基因上可能存在的突變,我們對(duì)β-半乳糖苷酶基因各外顯子進(jìn)行測(cè)序分析,并在此基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能可能造成的影響。GLB1基因第2外顯子多肽鏈較保守且具有相對(duì)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域,因此本研究構(gòu)建此區(qū)域表達(dá)載體,后期可得到能同時(shí)識(shí)別正常蛋白和突變蛋白的β-半乳糖苷酶抗體,在臨床上可用于對(duì)該家族中其他成員就此插入突變進(jìn)行檢測(cè)。
　　 材料和方法：

5、
　　 1.研究對(duì)象
　　 一例經(jīng)臨床診斷為GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥的患者,其中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重惡化,并伴隨骨骼畸形,肝脾腫大等典型GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥癥狀。患者父母雙方均健康,非近親婚配,均無(wú)異常家族史,也納入檢測(cè)范圍;正常對(duì)照樣本選自隨機(jī)健康人群?；颊吆驼?duì)照均獲得該遺傳分析研究的知情同意權(quán)。
　　 2.研究方法：
　　 2.1β-半乳糖苷酶基因16個(gè)外顯子序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析
　　 取

6、研究對(duì)象外周靜脈血5mL加EDTA抗凝,用常規(guī)的酚/氯仿法提取DNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。設(shè)計(jì)合成引物,PCR擴(kuò)增基因組DNA中β-半乳糖苷酶基因(GLB1)的各個(gè)外顯子,然后直接進(jìn)行測(cè)序分析,尋找突變位點(diǎn)。
　　 2.2基于同源建模服務(wù)器SWISS-MODEL的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
　　 在SWISS-MODEL服務(wù)器上構(gòu)建突變蛋白和正常蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型,并比較兩者的差異,從而預(yù)測(cè)突變對(duì)整個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的影響。

7、
　　 2.3β-半乳糖苷酶第2外顯子表達(dá)載體的構(gòu)建和GST融合蛋白的表達(dá)
　　 人類β-半乳糖酶基因(GLB1)第2外顯子經(jīng)克隆后連入PGEX-5X-1表達(dá)載體,然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)含該外顯子的GST融合蛋白,之后采用SDS-PAGE方法檢測(cè)該融合蛋白GLB1-Exon2-GST的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.第10外顯子上新插入突變c.1019_1020 ins AGGC

8、的發(fā)現(xiàn)通過(guò)測(cè)序比對(duì)得到第10外顯子上一個(gè)AGGC四堿基的插入突變,該突變國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道,突變?cè)斐上掠伍_(kāi)放閱讀框的改變,在第17位堿基處形成一個(gè)終止密碼子。
　　 2.突變蛋白同源模型的構(gòu)建由建模得到的突變蛋白和正常蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型分析得出該突變對(duì)原蛋白結(jié)構(gòu)造成巨大影響,體現(xiàn)在氨基酸殘基超過(guò)1/3的缺失和突變蛋白自身所含氨基酸殘基相對(duì)空間位置的變化,這直接導(dǎo)致了β-半乳糖苷酶酶活性的喪失。
　　 3.GLB1-Exon

9、2 GST融合蛋白的表達(dá)通過(guò)基因工程手段,我們成功構(gòu)建了GLB1-Exon2的PGEX-5X-1重組表達(dá)載體,之后順利轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α菌株,并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)確定融合蛋白GLB1-Exon2-GST的正確表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.GM1患者GLB1基因第10外顯子上新發(fā)現(xiàn)的c.1019_1020 ins AGGC插入突變引起原蛋白分子量的顯著降低且分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化,從而導(dǎo)致β-半乳糖苷酶活性的