MDSCs定向分化的調(diào)控及其在壓力性尿失禁中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、女性壓力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)是指由于各種原因引起盆底肌肉筋膜組織松馳，膀胱和尿道解剖位置改變及尿道阻力降低，致使排尿自禁功能障礙，從而在腹壓突然增高時(shí)尿液不自主流出的一種疾病。SUI是臨床常見(jiàn)疾病，23％～44％的婦女有尿失禁癥狀，隨人口老年化加重，其發(fā)病率會(huì)不斷升高，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且會(huì)加重社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。 導(dǎo)致SUI的關(guān)鍵機(jī)制主要有兩種，尿道固有括約肌缺陷(i

2、ntrinsic sphincterdeficiency，ISD)和膀胱頸支撐功能障礙。ISD是導(dǎo)致女性SUI的重要原因，傳統(tǒng)的治療方法對(duì)于ISD所致的SUI的療效差。從本質(zhì)上改善ISD的方法是糾正其成肌功能障礙，即恢復(fù)ISD所致SUI患者成肌細(xì)胞功能。隨著組織工程和基因治療發(fā)展及干細(xì)胞研究深入，干細(xì)胞移植成為肌肉組織損傷修復(fù)的重要手段，這也為ISD型壓力性尿失禁的治療帶來(lái)了希望。 肌源性干細(xì)胞(Muscle derived s

3、tem cells，MDSCs)是高度未分化的多潛能細(xì)胞，在適當(dāng)條件下，MDSCs可分化為骨骼肌成肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨樣細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌損傷時(shí)，骨骼肌干細(xì)胞可分化形成肌纖維參與肌損傷修復(fù)過(guò)程。將MDSCs注入心肌梗死或尿失禁模型大鼠，MDSCs可參與心肌或尿道平滑肌的修復(fù)。在人體，已有成功用MDSCs治療心肌梗死或壓力性尿失禁的的研究報(bào)道。 目前MDSCs向具體細(xì)胞分化的機(jī)制尚不完全明確，可能與移植后細(xì)胞所處環(huán)

4、境中的某些信號(hào)有關(guān)，不同的微環(huán)境可誘導(dǎo)MDSCs向不同的細(xì)胞分化，即MDSCs具有組織分化特異性。但是在MDSCs移植治療骨骼肌損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，MDSCs除分化為骨骼肌細(xì)胞外，在TGF-β等細(xì)胞因子的刺激下還可分化為成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致骨骼肌纖維化，而影響細(xì)胞移植的療效。在MDSCs移植治療壓力性尿失禁的研究中也發(fā)現(xiàn)：MDSCs或成纖維細(xì)胞移植到中段尿道周圍，對(duì)尿失禁的治療效果是相同的，提示：MDSCs移植后可能轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞參與尿道

5、修復(fù)。 我們推測(cè)：肌源性干細(xì)胞移植后，局部微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞釋放TGF-β1，誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞成纖維分化，而影響了MDSCs成肌功能。探討TGF-β1及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與肌源性干細(xì)胞成纖維分化之間的聯(lián)系，對(duì)更深入的認(rèn)識(shí)細(xì)胞移植治療在體分化狀況，提高細(xì)胞移植治療效果具有重要意義。 本研究以SD大鼠為研究對(duì)象，利用酶消化法和密度梯度離心法相結(jié)合，分離純化了MDSCs。利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了靶向Smad3基因的慢病毒載體。體

6、外shRNA抑制Smad3表達(dá)前后，Real-Time PCR及Western blot檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維化/成肌分化標(biāo)志蛋白表達(dá)變化；建立SUI大鼠模型，在體移植Smad3-shRNA基因修飾的MDSCs，檢測(cè)抑制Smad3表達(dá)對(duì)大鼠尿控功能及MDSCs體內(nèi)分化情況的影響。主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下： 一、MDSCs分離培養(yǎng)及成纖維分化的研究 1.通過(guò)膠原酶XI和Dispase酶聯(lián)合消化分離和preplate差速

7、貼壁技術(shù)，可以獲得純度較高的SD大鼠MDSCs，在適宜的培養(yǎng)條件MDSCs增殖活力較好，可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。 2.MDSCs的特征為：①低粘附性、小圓形、折光性強(qiáng)；②免疫表型：Sca-1(+)、CD34(+)、CD45(-)、Desmin(+)；③有形成肌管的能力，但較肌衛(wèi)星細(xì)胞弱。利用MDSCs的特征組成的鑒定系統(tǒng)可以作為鑒定MDSCs的可靠方法。 3.MDSCs能在TGF-β1刺激下表達(dá)成纖維分化標(biāo)志蛋白Vimentin

8、，而其成肌分化標(biāo)志蛋白Desmin則被抑制，且存在明顯的時(shí)間依賴關(guān)系，提示TGF-β1可能通過(guò)對(duì)MDSCs，即干細(xì)胞水平影響，參與了肌損傷修復(fù)/纖維化進(jìn)程。 二、靶向Smad3基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 1.設(shè)計(jì)4對(duì)siRNA干擾序列，并將其成功連接入pGCSIL-GFP載體，體外實(shí)驗(yàn)成功篩選出siRNA的最好靶點(diǎn)，靶點(diǎn)序列為：GGATGAAGTGTGTGTAAAT。 2.成功構(gòu)建Smad3基因ShRN

9、A慢病毒載體。用其感染MDSCs，感染效率在80％以上，此時(shí)Smad3蛋白表達(dá)的抑制效率達(dá)80％。 三、靶向干擾Smad3對(duì)MDSCs定向分化及SUI大鼠尿控功能的影響 1.Smad3基因RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染MDSCs可有效阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的Vimentin表達(dá)升高，Desmin表達(dá)下調(diào)。說(shuō)明TGF-β1可能是通過(guò)激活Smad3蛋白表達(dá)，參與了肌損傷--纖維化的進(jìn)程，阻斷Smad3可能具有抑制MDSCs成纖維分化

10、，維持其成肌特性的作用。 2.MDSCs細(xì)胞在體移植實(shí)驗(yàn)表明：MDSCs移植可修復(fù)替代損傷的括約肌細(xì)胞，能顯著提高腹壓漏尿點(diǎn)壓(ALPP)，改善尿失禁大鼠的控尿功能。抑制Smad3表達(dá)后，MDSCs成肌分化能力增強(qiáng)，顯著提高SUI大鼠細(xì)胞移植治療的遠(yuǎn)期療效。 總之，本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制MDSCs中Smad3基因表達(dá)，siRNA在有效抑制靶基因表達(dá)的同時(shí)可以有效降低成纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)，維持成肌分化標(biāo)志蛋白表達(dá)，改