控制性超排卵中卵泡期孕酮水平的影響及生長激素應(yīng)用的研究.pdf

1、控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)是指通過運用促排卵藥物使得一個月經(jīng)周期能夠獲得足夠數(shù)量的卵子，以便得到多個可供移植的胚胎。COH 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體外受精一胚胎移植 (in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治療不孕癥中，并成為治療中的關(guān)鍵步驟之一。20多年來隨著輔助生殖技術(shù)(assistedreproductive tech

2、nology，ART)的不斷開展與深入研究，用于ART的藥物有了很大的發(fā)展、COH方案和監(jiān)測手段不斷得以完善。雖然臨床妊娠率在不斷提高，然而在啟動周期中仍有超過半數(shù)的未能成功，目前探討并改善影響成功率的因素已成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門話題。卵子成熟障礙，卵巢反應(yīng)低下，受精失敗，胚胎發(fā)育障礙，著床障礙等都是IVF-ET失敗的原因。 本課題分為兩大部分，主要研究方法和結(jié)果如下： 第一部分COH中卵泡早、晚期孕酮水平對IVF結(jié)局的

3、影響 本部分的研究工作是對部分接受IVF助孕的不孕癥患者的COH資料進行回顧性分析，探討卵泡早期孕酮水平對IVF結(jié)局的影響。首先我們對2003年5月至2005年1月538名接受垂體降調(diào)節(jié)短方案超排患者的卵泡早期孕酮水平進行分析。根據(jù)她們在注射促性腺激素(Gonadotropin，Gn)第4天的血清孕酮水平分為三組：A組，血清孕酮≤lng/ml者367例；B組，血清孕酮lng/ml-3 ng/ml者106例；C 組，血清孕酮>3

4、ng/ml 者65例，回顧性分析各組患者的一般資料、COH資料及IVF結(jié)局。 結(jié)果：各組間注射hCG 日的E2，LH，P 水平，獲卵數(shù)，移植胚胎數(shù)均無顯著差異。受精率，優(yōu)質(zhì)胚胎率隨著孕酮水平的升高逐漸降低，但無顯著差異。我們發(fā)現(xiàn)B和C組超排卵第4天黃體生成素水平和孕酮水平比A組顯著升高(P<0.01)，雌激素也顯著升高(P 分別<0.05和<0.01)；C組的妊娠率和著床率比A組顯著降低(P<0.01)；而早期流產(chǎn)率顯著增高(P

5、<0.05)：所以繼續(xù)妊娠率較A組顯著降低(P<0.01)，C組的著床率比B組顯著降低，但是早期流產(chǎn)率沒有顯著差異。B組的早期流產(chǎn)率較A組顯著升高(P<0.05)。 結(jié)論：控制性超排卵中短方案垂體降調(diào)節(jié)中，注射Gn第4天，即卵泡早期孕酮水平>3 ng/ml，胚胎著床率，妊娠率降低，孕酮水平>1 ng/ml，早期流產(chǎn)率增加。接著，對2003年4月至2004年12月1408例不孕癥患者，分別接受短方案垂體降調(diào)節(jié)692人和長方案垂體降

6、調(diào)節(jié)716人卵泡晚期的孕酮水平進行分析，其中，按照注射HCG日血清孕酮濃度的不同分別分為 3 組：短方案組：血清孕酮≤lng/ml 者462例，血清孕酮lng/ml-2 ng/ml 者211例，血清孕酮>2 ng/ml者19例；長方案組：血清孕酮≤lng/ml者588例，血清孕酮lng/ml-2 ng/ml者108例，血清孕酮>2 ng/ml者20例，回顧性分析體外受精的結(jié)局。 結(jié)果：長短方案各組間獲卵數(shù)，受精率，卵裂率，優(yōu)胚率

7、無明顯差異，隨著孕酮水平的升高，著床率和妊娠率有逐漸降低，自然流產(chǎn)率升高趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：控制性超排卵中，hCG注射日孕酮水平對著床率，臨床妊娠率，自然流產(chǎn)率無顯著影響。 第二部分生長激素在COH中對卵巢反應(yīng)低下患者的應(yīng)用價值及可能機制的初步研究 在控制性超排卵中，卵巢反應(yīng)低下是困擾輔助生殖臨床醫(yī)生的一大難題之一，也是COH周期取消的常見原因。人們已經(jīng)認識到促性腺激素并非是卵巢功能的唯一調(diào)節(jié)因子，生長激素及各

8、種多肽生長因子對卵巢和卵泡發(fā)育也具有重要的意義。本部分的研究工作是探討生長激素對控制性超排卵中卵巢反應(yīng)低下的患者的應(yīng)用價值。將38名符合卵巢反應(yīng)低下的不孕癥患者，隨機分為生長激素組(21名)和對照組(17名)，均采用短方案降調(diào)節(jié)，其中生長激素組從周期第2-3天每天注射4IU生長激素，比較兩組超排卵過程及結(jié)局。 結(jié)果：兩組間病人的年齡、不孕原因和不孕年限均無明顯差異；兩組病人超排過程中的各項參數(shù)，包括各時期內(nèi)分泌結(jié)果，促性腺激素的

9、使用時間，劑量，獲卵數(shù)，受精率，卵裂率，優(yōu)質(zhì)胚胎率，移植胚胎數(shù)目均無顯著性差異，最終 GH 組獲得了42.1％的臨床妊娠率，而對照組僅為13.3％，GH 組有一例患者為宮外妊娠，其余均在繼續(xù)妊娠中。兩組病人中，超排周期第二天血清GH、抑制素、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP3 水平均無顯著差異；超排周期第六天兩組病人的抑制素水平無顯著差異；注射HCG 日中，GH組血清IGF-Ⅰ水平較對照組顯著增加(P<0.000)；IGF-Ⅱ水平在兩

10、組間無顯著差異；GH組血清IGFBP3 水平較對照組顯著下降(P<0.000)；兩組病人卵泡液中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFBP3水平均無顯著差異。 本研究對GH提高臨床妊娠率進行了初步探討。我們通過建立了卵巢黃素化顆粒細胞的體外培養(yǎng)體系，并向培養(yǎng)體系中添加不同濃度的GH和/或FSH，探討生長激素在體外對顆粒細胞的分泌類固醇激素(E2和P)的調(diào)節(jié)作用，進而為進一步探討其對卵泡發(fā)育的影響打下基礎(chǔ)。 結(jié)果：隨著GH濃度的增

11、加，培養(yǎng)液中E2水平不斷增加，當GH濃度為500ng/ml時，與空白對照組比較，E2水平有顯著差異性(P<0.05)；當GH濃度為1000ng/ml時，與空白對照組比較，E2水平也有顯著差異性(P<0.05)：而各組培養(yǎng)液中P水平無顯著差異：在相同濃度的FSH作用下隨著GH濃度的增加，培養(yǎng)液中E2水平不斷增加；在相同濃度GH作用下，隨著FSH濃度的增加，培養(yǎng)液中E2水平不斷增加，其中當FSH濃度在1000ng/ml時，分別與相同GH濃度

12、的FSH空白組比較。E2水平差異具有顯著性(P<0.05)；而各組間P水平無顯著差異。 然后收集經(jīng)過GH(500ng/ml)作用后的人卵巢顆粒細胞和空白對照組顆粒細胞為材料，應(yīng)用以SMART(Switching Mechanism At 5′endof the RNA Transcript)技術(shù)為基礎(chǔ)的抑制性消減雜交技術(shù)(SuppressionSubtractive Hybridization，SSH)，以GH作用后的顆粒細胞為

13、檢測子(tester)，以對照組顆粒細胞為驅(qū)趕子(driver)，獲得了GH作用后差異表達的cDNA產(chǎn)物。G3PDH基因擴增實驗顯示消減效率達10個循環(huán)左右(約1000倍)。進一步將cDNA產(chǎn)物克隆入pUCm-T載體，通過藍白斑實驗和PCR檢測，篩選出在人卵巢顆粒細胞中，GH作用前后差異表達的克隆。反向斑點雜交結(jié)果顯示大部分克隆在GH作用前后的顆粒細胞中的表達有差異。選取其中60個與GenBank比較，顯示其中52個EST代表23個已知