基于人抗體可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)和拮抗肽設(shè)計新型TNF-α人源小分子拮抗劑.pdf

1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種多功能的細胞因子，參與許多重要的生理功能，但TNF-α的過表達會破壞機體的免疫平衡，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Crohn’s病等多種疾病密切相關(guān)。基礎(chǔ)和臨床研究都證實，抑制TNF活性是治療這類疾病的一個有效措施。目前，已被FDA批準的TNF-α拮抗劑有TNFRII-F<,C>融合蛋白和抗TNF-α單抗，但昂貴的生產(chǎn)成本或潛在的誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)的副作用，使其廣泛應(yīng)用受到一定限制。開發(fā)新型TNF-α拮

2、抗分子必要而有意義，人源小分子抗體由于其獨特的治療價值而受到人們的矚目，但高親和力人源抗體的獲得有一定困難。 本實驗室在TNF-α拮抗分子研究方面取得了一定進展：自主研制的鼠抗TNF-α中和單抗Z12能特異性識別TNF-α的141～146位這一功能表位；根據(jù)理論模擬構(gòu)建的TNF/抗體相互作用的復(fù)合物模型，設(shè)計獲得功能性拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7)；利用人抗體可變區(qū)重鏈框架(V<,H>5)展示拮抗肽(PT2、PT3、P

3、T4)，設(shè)計并合成獲得單域抗體(PTVH5)，其活性明顯好于拮抗肽，證明抗體可變區(qū)框架適于展示拮抗肽。 基于此，借助已建立的“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新型功能分子”的技術(shù)平臺，本論文提出以人抗體可變區(qū)(重鏈、輕鏈)框架展示拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7)設(shè)計虛擬單鏈抗體構(gòu)象庫，借助TNF/抗體相互作用動態(tài)模式，虛擬篩選新型TNF-α單鏈抗體分子，合成獲得單鏈抗體分子并通過生物學(xué)實驗驗證其功能。 研究結(jié)果

4、如下： 1．在單域抗體PTVH5(用V<,H>5框架來展示拮抗肽PT2、PT3、PT4)的基礎(chǔ)上，按照“結(jié)構(gòu)匹配、靜電互補”的原則，從人的七類輕鏈可變區(qū)(V<,L>)通用框架中選擇與之匹配的V<,κ>I框架，用拮抗肽PT7替換V<,κ>I框架中的CDR3區(qū)，通過Linker連接，設(shè)計成新型分子TSA1。理論分析發(fā)現(xiàn)，TSA1穩(wěn)定性較好，識別TNF-α的14l～146功能位點(即Z12識別的位點)。生物學(xué)實驗證明，TSA1能與TN

5、F-α結(jié)合、抑制TNF-α與TNFR的結(jié)合、抑制TNF-α介導(dǎo)的細胞毒作用及NF-κB的激活，而且TSA1的活性比之前設(shè)計的單域抗體有顯著提高(中和TNF-α介導(dǎo)的細胞毒實驗中，單域抗體PTVH5的IC<,50>值為56.5+3.2μmol/L；TSAl的IC<,50>值為0.098±0.01 μmol/L)。但與S-Remicade(上市抗體Remicade的單鏈形式)相比，TSA1的活性較弱。 2．從框架的合理選擇和拮抗肽

6、的合理定位兩方面來優(yōu)化設(shè)計方案，設(shè)計虛擬單鏈抗體構(gòu)象庫，以期篩選得到活性更好的拮抗分子。TSA1與TNF的動態(tài)作用模式表明，在與TNF的結(jié)合過程中，重鏈CDR3(HCDR3，即拮抗肽PT4)起著關(guān)鍵的作用。鑒于此，根據(jù)4種拮抗肽活性的差異(PT7>PT4>PT2≈PT3)，將其中活性最好的PT7安排在HCDR3的位置，其余三個拮抗肽PT2、PT3、PT4在HCDR1、HCDR2、LCDR3的位置上隨機組合。結(jié)合七類V<,H>和七類V<,

7、L>框架產(chǎn)生的49種框架組合，利用計算機模建技術(shù)，設(shè)計人單鏈抗體構(gòu)象庫，虛擬篩選得到以V<,λ>I與V<,H>5為框架設(shè)計的新型單鏈抗體TSA2(拮抗肽PT2、PT3、PT7分別替換HCDR1、HCDR2、HCDR3，拮抗肽PT4替換LCDR3)。理論分析表明，TSA2在與TNF-α的相互作用區(qū)域、結(jié)合自由能、分子間氫鍵等方面均顯著優(yōu)于TSA1。生物學(xué)實驗證明，與TSA1相比，TSA2的活性顯著提高，與理論預(yù)測結(jié)果一致。而且TSA2的活