脊髓PPARα對肥胖大鼠外周炎癥及炎性痛覺過敏作用和機理的研究.pdf

1、研究背景:
　　大量的肥胖動物模型研究表明肥胖可增加機體對疼痛的敏感性。過氧物酶體增殖體激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors;PPARs)作為重要的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族。目前研究有三種不同的異構(gòu)體，分別是PPARα，PPARβ/δ，PPARγ。它們均在細(xì)胞分化、增殖及脂質(zhì)代謝等生理過程中扮演著重要的角色。PPARα對于炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，目前研究其在中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)包括大腦、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)等均有表達(dá)。最近的研究表明，在正常動物，中樞系統(tǒng)PPARα參與了外圍炎癥和炎性痛覺過敏。然而，在肥胖動物模型，在外圍組織包括脂肪和肌肉其PPARα的表達(dá)卻明顯降低。這些結(jié)果讓我們猜測到肥胖可能引起中樞水平PPARα的表達(dá)異常，并進(jìn)而影響周圍炎癥反應(yīng)和炎性痛覺過敏。這也許是肥胖增加疼痛敏感性的一個重要的分子機制。
　　脊髓是疼痛感知的重要的中繼站，愈來愈多的脊髓水平的研究證實，外周炎癥及組織損傷通

3、過各種遞質(zhì)及通路可以引起脊髓水平相關(guān)功能分子蛋白或基因發(fā)生一系列的變化，此種變化可導(dǎo)致脊髓傷害性神經(jīng)元的持續(xù)興奮性增強，形成所謂的中樞敏化現(xiàn)象，同時脊髓也可以通過信號傳遞及時反饋調(diào)節(jié)外周感知和炎癥。核因子-κ B(Nuclear factor-kappa B，NF-κ B)是一種重要的炎癥相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到重要作用。包括炎癥、突觸傳遞、學(xué)習(xí)、記憶和疼痛等在內(nèi)的許多生理活動或病理過程，都有核因子-κB參與。NF-κB參與

4、生理及病理活動是通過調(diào)控其下游的眾多因子來實現(xiàn)，這些因子包括細(xì)胞因子(IL-1β、 TNF-α)，促炎癥酶COX-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)等。可見上述信號通路在疼痛的形成和維持中扮演著重要角色。
　　因此，本研究通過建立肥胖大鼠模型，探討肥胖情況下模型大鼠脊髓水平PPARα表達(dá)情況;同時采用注射角叉菜膠誘導(dǎo)急性炎癥模型，通過檢測脊髓水平PPARα及NF-κB、

5、IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS的表達(dá)，進(jìn)一步明確其在外圍炎癥和炎性痛覺過敏中可能作用及其分子機制，為治療疼痛提供新的可能作用靶點。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 肥胖大鼠脊髓PPARα及炎性因子表達(dá)的研究
　　目的:
　　建立肥胖大鼠動物模型，探討PPARα及炎性因子在肥胖大鼠脊髓水平中的表達(dá)和活性，以闡明肥胖是否能夠引起脊髓水平PPARα的表達(dá)異常，并檢測肥胖大鼠脊髓水平部分炎性因子的表達(dá)

6、情況。
　　方法
　　1.肥胖大鼠動物模型的建立，SD雄性大鼠隨機分為兩組（HF與LF組），分別給予高脂肪食物(45％ kcal as fat;Research Diets，New Brunswick，NJ，USA)和低脂肪食物(10％ kcal as fat;Research Diets，New Brunswick，NJ，USA)作為日常飲食，飼養(yǎng)12周。
　　2.大鼠飼養(yǎng)至第10周時，經(jīng)側(cè)腦室(ICV)注射不同劑量

7、(0.1，0.5 and1.0μg/h)的PEA，通過滲透壓微泵技術(shù)注射aCSF為對照，注射周期為2周。
　　3.采用Western blot技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù)檢測脊髓PPARα表達(dá)水平，Western blot技術(shù)測定炎性因子（IL-1β，TNF-α，COX-2，iNOS）蛋白水平，轉(zhuǎn)錄因子試劑盒檢測PPARα，PPARβ，PPARγ的表達(dá)水平。
　　4.臨床分析儀測定血漿中葡萄糖、膽固醇及甘油三酯含量，胰島素、瘦蛋白

8、及脂聯(lián)素由ELISA試劑檢測。
　　結(jié)果:
　　1.分組喂養(yǎng)4周后，相比于LF組，HF組表現(xiàn)出明顯的體重增加趨勢，至12周體重變化更為明顯(P＜0.05)。HF組大鼠的血漿胰島素、瘦蛋白及膽固醇含量升高(P＜0.05)，脂聯(lián)素含量明顯降低(P＜0.05)，血漿中葡萄糖及甘油三酯含量并未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。
　　2.大鼠喂養(yǎng)8周時，HF組大鼠脊髓中PPARα表達(dá)量開始低于LF組，在第12周時，HF組PPARα表

9、達(dá)量、表達(dá)活性相比于LF組有更加明顯的降低(P＜0.05)。肥胖大鼠ICV注射1.0μg/h PEA，PPARα表達(dá)量與表達(dá)活性在肥胖大鼠中達(dá)到了對照組（LF組）的同等水平;經(jīng)過注射aCSF后，PPARα表達(dá)量與表達(dá)活性仍舊維持在HF組注射前水平(P＞0.05)。
　　3.熒光免疫檢測發(fā)現(xiàn)HF與LF兩組的脊髓灰白質(zhì)中PPARα均有表達(dá)，HF組中PPARα的表達(dá)較LF組顯著降低（P＜0.05）。
　　4.炎性因子的檢測結(jié)果示H

10、F與LF組IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS都沒有顯著差異(P＞0.05);當(dāng)ICV注射PEA和aCSF后，兩組的炎性因子表達(dá)同樣沒有差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　高脂飲食成功構(gòu)建肥胖大鼠模型;肥胖大鼠脊髓PPARα表達(dá)及活性明顯降低。而炎性因子IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS并無明顯變化。肥胖大鼠ICV注射1.0μg/h PEA，能夠使得PPAR u表達(dá)量及活性恢復(fù)到正常水平。
　　第

11、二部分 肥胖大鼠脊髓水平PPARα下調(diào)與外周炎癥和炎性痛覺過敏增強關(guān)系的研究
　　目的:
　　利用注射角叉菜膠建立炎性疼痛模型，研究PPARα的異常表達(dá)與周圍炎癥反應(yīng)和炎性痛覺過敏的關(guān)系，利用siRNA載體對PPARα基因進(jìn)行沉默，探討PPARα異常表達(dá)與周圍炎癥反應(yīng)和炎性痛覺過敏的分子機理。
　　方法:
　　1.建立肥胖大鼠動物模型，SD雄性大鼠隨機分為兩組（HF組與LF組），分別給予高脂肪食物(45％)、低脂

12、肪食物(10％)作為日常飲食，飼養(yǎng)12周。
　　2.10周時經(jīng)側(cè)腦室(ICV)注射1.0μg/h的PEA，通過滲透壓微泵技術(shù)注射aCSF為對照，注射周期為2周;大鼠右后爪足底皮下注射50μl的3％角叉菜膠(CAR)。
　　3.CAR注射前1h及注射后第2h、4h、6h、8h以及24 h，用von Frey以up-down法推算大鼠的機械痛閾值，按照Hargreaves法測定大鼠的熱痛閾值，用足趾容積測量儀檢測大鼠右側(cè)足趾腫脹

13、程度。
　　4.ICV注射PEA的HF組大鼠經(jīng)麻醉后，微量注射器分別吸取10μl PPARαsiRNA及陰性對照，針頭由椎間孔插入蛛網(wǎng)膜下區(qū)域進(jìn)行注射，根據(jù)大鼠的甩足或甩尾反應(yīng)確定針頭是否插入正確位置，注射完畢后，火鼠放回籠了飼養(yǎng)。
　　5.采用Western blot技術(shù)檢測脊髓中PPARα、NF-κB p65、炎癥因子及IκBα表達(dá)水平，轉(zhuǎn)錄因子分析試劑盒檢測PPARα、NF-κ B p65 DNA結(jié)合活性。
　　

14、6.采用單因素回歸分析進(jìn)行PPARα與足腫脹容積、機械痛閾值及熱痛閾值的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.注射角叉菜膠后，兩組大鼠都出現(xiàn)了熱痛覺過敏、機械性觸誘發(fā)痛和足腫脹反應(yīng)。HF組大鼠在第2小時開始出現(xiàn)熱痛覺過敏、機械性痛覺過敏與足腫脹，明顯早于LF組大鼠，在注射后4小時時，熱痛覺過敏與機械性痛覺過敏達(dá)到最大值(P＜0.05)，在注射后2-24小時內(nèi)，HF組大鼠存在更加明顯的足腫脹程度(P＜0.05);ICV注射1.0μ

15、g/h PEA后，HF組大鼠熱痛覺過敏、機械性痛覺過敏與足腫脹反應(yīng)明顯減弱，與LF組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義((P＞0.05)。
　　2.注射角叉菜膠6h后，HF與LF組大鼠，IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS的表達(dá)量都有非常顯著的上升，HF組大鼠增加幅度更明顯(P＜0.05);對HF組大鼠給予PEA注射后，IL-1β，TNF-α，COX-2和iNOS表達(dá)量明顯下降，與LF組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

16、r>　　3.經(jīng)注射角叉菜膠6h后，HF組、LF組的IκBα蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，HF組的下降程度更加明顯（P＜0.05）。HF組經(jīng)注射PEA后，IκBα蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)上升恢復(fù)趨勢;HF組、LF組的NF-κB p65蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢，HF組的上升程度更加明顯(P＜0.05)。HF組經(jīng)注射PEA后，NF-κB p65蛋白表達(dá)量與活性呈現(xiàn)下降趨勢，與LF組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.注射角叉菜膠6

17、h后測定的PPARα表達(dá)量與大鼠在4h時的熱痛閾成正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)，與機械痛閾無相關(guān)關(guān)系(P=0.07)，而與足腫脹成負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。
　　5.PPARα siRNA能夠使得PPARα蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，脊髓中PPARα基因沉默后，ICV注射PEA對熱痛覺過敏、機械性痛覺過敏和足趾腫脹度均恢復(fù)到了HF組水平。
　　結(jié)論:
　　在肥胖大鼠炎性疼痛模型中，PPARα蛋白的表達(dá)及活性下調(diào)，該蛋白的下調(diào)使