脊髓星形膠質(zhì)細胞及其Toll樣受體3參與大鼠慢性胰腺炎機械性痛覺過敏的實驗研究.pdf

1、慢性胰腺炎是臨床常見病，80-90％的慢性胰腺炎病人都有持續(xù)性腹部疼痛，其嚴重的、反復發(fā)作的腹部疼痛是病人的主要癥狀之一。然而，慢性胰腺炎導致疼痛的機制尚不明確，解釋其引起疼痛的機制也有很多，包括胰腺本身和胰腺外部原因。關(guān)于神經(jīng)病理性疼痛的研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛傳導通路發(fā)生了異常。有研究發(fā)現(xiàn)在某些胰腺病變，包括慢性胰腺炎、胰腺癌和胰性腦病，可以導致“神經(jīng)重塑“和胰腺神經(jīng)支配發(fā)生變化。以上結(jié)果提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能參與了慢性胰腺炎導致的

2、慢性疼痛。
　　脊髓背角神經(jīng)-免疫系統(tǒng)和神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細胞的相互作用在神經(jīng)可塑性變化和神經(jīng)病理性痛中起了十分重要的作用。有研究表明神經(jīng)-免疫系統(tǒng)相互作用在慢性胰腺炎疼痛中非常重要。以往表明脊髓背角星形膠質(zhì)細胞在大鼠慢性胰腺炎模型發(fā)生了活化，同時抑制星形膠質(zhì)細胞的活性可以減輕慢性胰腺炎引起的疼痛。我們推測星形膠質(zhì)細胞在此過程中可能被某些受體活化，然后導致一系列分子表達變化和信號通路的活化，參與了慢性胰腺炎引起的疼痛。但是具體那種分

3、子參與了慢性胰腺炎引起的星形膠質(zhì)細胞的活化未見報道。Toll樣受體（TLRs）在慢性痛病理條件下脊髓背角神經(jīng)-免疫相互作用和神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)細胞相互作用中起到了十分重要的作用。有學者表明TLRs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別是神經(jīng)膠質(zhì)細胞，有廣泛表達。在哺乳動物神經(jīng)膠質(zhì)細胞中TLRs的表達已經(jīng)被確認。在這些受體中，TLR2-4被認為主要介導了神經(jīng)病理性疼痛。通常來說，在內(nèi)源性或是外源性信號通路的刺激下，活化的TLRs能夠?qū)е律窠?jīng)膠質(zhì)細胞的活化，

4、調(diào)節(jié)疼痛相關(guān)的炎癥因子。有趣的是，TLRs同樣有可能在胰腺炎的發(fā)生過程中發(fā)揮了作用。最近有報道表明腹腔內(nèi)注射TLR3可以成功的引起慢性胰腺炎樣的病理變化。在本實驗中，我們假設TLRs，尤其是TLR2-4，參與了慢性胰腺炎病理條件下星形膠質(zhì)細胞的活化和疼痛的發(fā)生。我們的實驗結(jié)果表明脊髓TLR3參與了大鼠慢性胰腺炎模型的疼痛。慢性胰腺炎病理條件下脊髓的“TLR3-星形膠質(zhì)細胞-IL-1β/MCP-1”的正反饋通路可能為TLR參與慢性胰腺炎疼

5、痛的機制，或許可以成為臨床慢性胰腺炎病人疼痛的緩解的治療靶點。
　　目的：
　　慢性胰腺炎導致的疼痛的機制目前為止尚不明確。以前的很多結(jié)果表明星形膠質(zhì)細胞在疼痛過程中得到了活化。盡管如此，星形膠質(zhì)細胞在慢性胰腺炎病理過程中是否發(fā)生了活化以及其發(fā)生活化的分子機制尚不明確。本實驗的目的為探討星形膠質(zhì)細胞在慢性胰腺炎病理過程中是否發(fā)生了活化以及TIRs是否參與星形膠質(zhì)細胞的活化和慢性胰腺炎引起的疼痛發(fā)作。
　　方法：

6、　　1.動物分為慢性胰腺炎實驗組，假手術(shù)組和正常組。雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250-300g，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。術(shù)前大鼠禁食水12h。麻醉實驗動物，常規(guī)消毒，沿腹白線做正中切口剖腹，尋找十二指腸并找到胰腺，用微型動脈夾阻斷胰膽管肝門部。用4號靜脈頭皮針經(jīng)腸壁穿刺入胰膽管，并用絲線固定靜脈針，通過恒流靜脈輸液泵注射含2％TNBS的PBS（PH7.4），共0.4ml，持續(xù)60min，注畢后關(guān)閉恒流泵，維持壓力

7、50min。對照組注射等體積的生理鹽水。除去動脈夾及絲線，逐層關(guān)閉腹腔。整個手術(shù)操作過程嚴格執(zhí)行無菌操作。檢測各組血清和胰腺組織細胞因子（TNF-?、IL-1。COX-1和α-SMA）的表達變化。分別于0點，1周和5周對各組大鼠胰腺HE染色后進行病理評分。同時從0點到第5周實時監(jiān)測各組大鼠的RFs值。利用免疫熒光和RE-PCR檢測星形膠質(zhì)細胞標志物在不同時間點的表達，westblotting檢測TLR2-4在不同時間點的表達。免疫熒光雙

8、標研究TLR3與星形膠質(zhì)細胞標志物的共存關(guān)系。
　　2.慢性胰腺炎組給予LAA拮抗星形膠質(zhì)細胞的活性，利用RT-PCR驗證LAA拮抗效果；同時檢測RFs值的和星形膠質(zhì)細胞標志物的變化情況。
　　3.慢性胰腺炎組給予TLR3反義探針拮抗TLR3的表達，利用westblotting驗證TLR3反義探針拮抗效果；同時檢測RFs值的和星形膠質(zhì)細胞標志物的變化情況。
　　4.RT-PCR檢測各組大鼠脊髓細胞因子，如TNF-?，I

9、L-1，IL-6，COX2和MCP-1的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.在假手術(shù)組和正常組，胰腺組織HE染色表現(xiàn)正常。在TNBS注射5周后，實驗組大鼠胰腺HE染色表現(xiàn)出明顯的胰腺腺泡萎縮，炎細胞浸潤，組織纖維化和間質(zhì)增生。血清淀粉酶、TNF-?和IL-1在實驗組顯著升高。胰腺組織的TNF-?、IL-1、COX-1和α-SMA顯著升高。在此同時，TNBS注射可導致RFs值的從開始到第5周的持續(xù)性升高。而假手術(shù)組和正常組RFs值

10、比較無統(tǒng)計學意義。TNBS注射組5周時RFs值與刺激正相關(guān)。與臨床慢性胰腺炎病人癥狀非常相似。因此我們確認TNBS可導致大鼠慢性胰腺炎以及腹部疼痛敏感度的增高。
　　2.我們在不同時間點處理各組大鼠觀察星形膠質(zhì)細胞活化標志物GFAP表達的變化情況。免疫熒光和RT-PCR結(jié)果顯示在假手術(shù)組和正常組，GFAP在胸椎背角的表達很低。在實驗組，有趣的是，脊髓GFAP的表達從TNBS注射后第1周到第5周顯著升高，第5周達到高峰，其表達的變化

11、與疼痛的變化成正相關(guān)。因此我們假設GFAP可能介導慢性胰腺炎導致的疼痛。
　　3.我們在不同時間點處理各組大鼠觀察TLR2-4蛋白表達的變化情況。Westernblotting結(jié)果顯示在假手術(shù)組和正常組，TLR2-4在胸椎背角的表達很低。在實驗組，有趣的是，脊髓TLR3的表達從TNBS注射后第一周到第五周顯著升高，第5周達到高峰，其表達的變化與疼痛的變化成正相關(guān)，這與以往我們的研究表明脊髓星形膠質(zhì)細胞的表達變化非常一致。因此我們假

12、設TLR3可能在星形膠質(zhì)細胞上表達，同時介導慢性胰腺炎導致的星形膠質(zhì)細胞的活化。免疫雙標顯示星形膠質(zhì)細胞特異性標志物GFAP與TLR3的共表達，初步證實了我們的假設。
　　4.接下來我們鞘內(nèi)注射GFAP的活性抑制劑LAA。RT-PCR證實了其拮抗效果。鞘內(nèi)注射LAA在一定程度上可以緩解慢性胰腺炎引起的疼痛，這種效應為計量依賴性。在假手術(shù)組或正常組，鞘內(nèi)注射LAA對RFs無影響。這些結(jié)果提示GFAP有可能參與到慢性胰腺炎導致的疼痛。

13、接下來我們鞘內(nèi)注射TLR3的反義探針拮抗TLR3的功能，westernblotting證實了其拮抗效果。鞘內(nèi)注射TLR3的反義探針在一定程度上可以緩解慢性胰腺炎引起的疼痛，這種效應為計量依賴性。在假手術(shù)組或正常組，鞘內(nèi)注射TLR3反義探針對RFs無影響。這些結(jié)果暗示了TLR3有可能參與到慢性胰腺炎導致的疼痛。考慮到TLR3在脊髓星形膠質(zhì)細胞的高表達，接下來我們探討了TLR3反義探針對于慢性胰腺炎介導的星形膠質(zhì)細胞活化的作用。我們實驗結(jié)果

14、發(fā)現(xiàn)TLR3反義探針顯著抑制了脊髓星形膠質(zhì)細胞的活化。然后我們又檢測了脊髓炎癥因子的表達情況，脊髓IL-1?，TNF-?，IL-6和MCP-1在慢性胰腺炎組表達明顯升高，而只有TNF-?和IL-6的mRNA表達不受TLR3反義探針的影響。有趣的是，脊髓COX2在正常組和胰腺炎組表達無顯著差異，TLR3反義探針也不影響其在脊髓的表達。
　　結(jié)論：
　　以上結(jié)果表明脊髓星形膠質(zhì)細胞和其表達的TLR3參與了大鼠慢性胰腺炎模型的疼痛