中樞過(guò)表達(dá)ACE2降低膽堿能突觸傳遞機(jī)制在改善高血壓中的作用研究.pdf

1、高血壓（Hypertension）一直是心血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，因其并發(fā)腦卒中、冠心病和心力衰竭等嚴(yán)重心血管疾病，嚴(yán)重影響人類健康。血壓升高和交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)是高血壓心血管功能紊亂的主要特征，并與高血壓并發(fā)癥的預(yù)后發(fā)展密切相關(guān)。頭端延髓腹外側(cè)區(qū)（RVLM）是維持基礎(chǔ)血壓和調(diào)控交感輸出的關(guān)鍵中樞，其結(jié)構(gòu)和功能異常是高血壓病理改變的一個(gè)重要機(jī)制。研究表明RVLM膽堿能突觸傳遞（Cholinergic synaptic transmission

2、）在自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）中是明顯增強(qiáng)的，因此其增強(qiáng)機(jī)制在誘發(fā)SHR的血壓升高和交感神經(jīng)過(guò)度興奮中具有重要作用。如何有效降低RVLM內(nèi)膽堿能突觸傳遞對(duì)改善高血壓心血管功能紊亂的機(jī)制策略研究具有重要意義。
　　眾所周知，腎素—血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)的異常活動(dòng)與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ACE2-Ang(1-7)-MAS軸是近年研究發(fā)現(xiàn)的RAS新途徑，作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE

3、）的同系物，ACE2可以催化AngⅡ生成Ang(1-7），Ang(1-7)可以特異性作用于G蛋白偶聯(lián)Mas受體產(chǎn)生與AngII效應(yīng)相反的心血管保護(hù)作用，因此ACE2-Ang(1-7)-MAS軸可能會(huì)成為治療高血壓的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)。有研究證實(shí)SHR的RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)ACE2可以引起長(zhǎng)效的降血壓效應(yīng)，但目前并不清楚ACE2是否通過(guò)減弱 RVLM內(nèi)膽堿能途徑從而產(chǎn)生改善高血壓的作用？因此本研究的主要目標(biāo)是明確ACE2過(guò)表達(dá)對(duì)高血壓大鼠RVLM

4、內(nèi)膽堿能突觸傳遞的作用及其可能機(jī)制。
　　炎癥刺激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)是RVLM神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)的一個(gè)重要機(jī)制。AngⅡ是一種前炎癥因子，有顯著的促炎作用，AngⅡ的增加通過(guò)激活膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子活性而增強(qiáng)炎癥因子的表達(dá)并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激。因此，也將明確ACE2過(guò)表達(dá)是否具有抑制高血壓大鼠RVLM內(nèi)炎癥因子合成的作用。
　　方法：本

5、實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用慢病毒載體將ACE2（Lenti-ACE2）過(guò)表達(dá)于SHR及WKY大鼠RVLM后，每周在相同時(shí)間段運(yùn)用大鼠尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)性血壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)其清醒狀態(tài)下血壓和心率的變化；高效液相色譜法檢測(cè)24小時(shí)尿中去甲腎上腺素（NE）含量，從而明確交感神經(jīng)活動(dòng)的活性；Western-blot方法檢測(cè)RVLM內(nèi)ACE2基因轉(zhuǎn)染后ACE2的表達(dá)情況等來(lái)驗(yàn)證ACE2的轉(zhuǎn)染效率。在ACE2過(guò)表達(dá)的大鼠上，對(duì)乙酰膽堿及其受體系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)。轉(zhuǎn)染

6、ACE2六周后，通過(guò)用試劑盒檢測(cè)RVLM微透析液中乙酰膽堿（ACh）的含量，來(lái)觀察過(guò)表達(dá)ACE2后ACh含量有無(wú)明顯變化；用Western-blot檢測(cè) MasR的表達(dá)變化，明確 ACE2-Ang（1-7）-MAS軸的變化，并通過(guò)Western-blot檢測(cè)囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體（VAChT）、ACh作用受體M2R、氧化應(yīng)激相關(guān)酶NOX4和SOD1蛋白表達(dá)情況；用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子TNFα，IL-1β，IL-6的含量變化；從整體動(dòng)

7、物水平，在大鼠RVLM內(nèi)急性微量注射乙酰膽堿阻斷劑阿托品，觀察其對(duì)大鼠血壓、心率、腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)等指標(biāo)的影響，從而明確其受體功能的變化。
　　結(jié)果：1．RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)ACE2對(duì)血壓和心率的影響
　　本實(shí)驗(yàn)分為WKY，SHR-GFP，SHR-ACE2三組。RVLM內(nèi)未轉(zhuǎn)染ACE2之前，SHR組與WKY組血壓及心率存在顯著差異(P<0.05)。第1周（未轉(zhuǎn)染之前）SHR大鼠的MAP（182±7mmHg）和HR[351±16

8、beats per min(bpm)]均明顯（P<0.05）高于正常血壓對(duì)照WKY大鼠的MAP（138±5mmHg）和HR（321±29bpm）。SHR分別轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組和Lenti-GFP組轉(zhuǎn)染后前3周收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓均無(wú)明顯差別。轉(zhuǎn)染后第4周SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組的MAP（149±3mmHg）明顯低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP的MAP（181±8mmHg）。SHR分別轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組和Le

9、nti-GFP組轉(zhuǎn)染后前3周心率無(wú)明顯變化，SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2第4周開(kāi)始出現(xiàn)降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第5周開(kāi)始SHR轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組的心率（289±11bpm）明顯低于SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組的心率（349±15bpm）。
　　2．SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染ACE2后對(duì)24小時(shí)尿液中的NE含量的影響
　　分別對(duì)WKY，SHR轉(zhuǎn)染Lenti-GFP和Lenti-ACE2后6周，用高效液相色譜法進(jìn)行24小

10、時(shí)尿液中去甲腎上腺素含量測(cè)定，觀察各組交感活動(dòng)的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組后6周24小時(shí)尿液中去甲腎上腺素含量（0.1664±0.021μg/24h）顯著高于WKY組（0.042±0.008μg/24h）。而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周24小時(shí)尿液中去甲腎上腺素含量（0.046±0.004μg/24h）顯著低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相比無(wú)差異。
　　

11、3．SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染ACE2對(duì)ACE2-Ang(1-7)-Mas軸表達(dá)的作用
　　結(jié)果顯示，SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組ACE2/α-tubulin表達(dá)（0.088±0.009）顯著低于正常WKY組ACE2/α-tubulin（0.147±0.018），而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周ACE2/α-tubulin（0.122±0.013）顯著高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相

12、比無(wú)差異。SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周，ACE2的表達(dá)明顯上調(diào)，與降壓的效果相對(duì)應(yīng)。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組MasR/α-tubulin表達(dá)（0.482±0.008）顯著低于正常WKY組MasR/α-tubulin（0.861±0.015），而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周MasR/α-tubulin（0.877±0.012）顯著高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相

13、比無(wú)差異。
　　4．RVLM內(nèi)過(guò)表達(dá)ACE2對(duì)RVLM內(nèi)乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的影響
　　SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組6周RVLM微透析液中ACh濃度（12.97±1.672μg/mL）顯著（P<0.05）高于WKY組（5.69±0.517μg/mL），SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周RVLM微透析液中ACh含量（7.017±0.932μg/mL）顯著（P<0.05）低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，但仍然稍高

14、于正常WKY組。
　　5．RVLM內(nèi)表達(dá)ACE2對(duì)RVLM內(nèi)VAChT、M2R、NOX4和SOD1蛋白表達(dá)的影響
　　SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組VAChT/α-tubulin表達(dá)（0.1139±0.016）顯著（P<0.05）低于WKY組VAChT/α-tubulin（0.061±0.009），而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周VAChT/α-tubulin（0.066±0.008）顯著（P<0.0

15、5）高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與正常WKY組相比無(wú)差異。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后NOX4/α-tubulin顯著低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與WKY組相比無(wú)差異。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后，SOD1/α-tubulin顯著高于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，與WKY組相比無(wú)差異。M2R/α-tubulin三組比較無(wú)差異。6．RVLM過(guò)表達(dá)ACE2對(duì)M型乙酰膽堿受體介導(dǎo)的緊張性心血管活動(dòng)

16、的影響
　　SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組6周RVLM核團(tuán)微量注射硫酸阿托品(M型乙酰膽堿受體阻斷劑)2 nmol后的MAP降低程度（55±4 mmHg）顯著（P<0.05）高于WKY組（15±1 mmHg）。SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周RVLM微量注射硫酸阿托品2 nmol后的MAP降低程度（23±7mmHg）顯著（P<0.05）低于SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組，但仍然稍高于正常WKY組。而WKY組HR降低

17、程度（10±3bpm），SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組HR降低程度（12±5bpm）和大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2組HR降低程度（17±5bpm）無(wú)顯著差異。
　　7．SHR RVLM過(guò)表達(dá)ACE2后對(duì)炎癥細(xì)胞因子含量變化的影響
　　結(jié)果顯示，SHR大鼠轉(zhuǎn)染Lenti-GFP組TNFa，IL-1β含量顯著（P<0.05）低于正常WKY組，而SHR大鼠RVLM內(nèi)轉(zhuǎn)染Lenti-ACE2后6周顯著（P<0.05）高于SHR大